La fluorescence native à 224 nm : Vers un nouveau mode de détection à fortes potentialités pour les techniques séparatives
Résumé
L'Electrophorèse Capillaire (EC) et la nano-chromatographie en phase liquide (nano-LC) sont deux techniques séparatives miniaturisées qui possèdent de fortes potentialités pour l'analyse de matrices biologiques. Cependant, dans certains cas, il peut s'avérer nécessaire de concentrer les molécules d'intérêt avant leur analyse afin d'optimiser la détection. Toutefois, quand cela est possible, il est également judicieux de recourir à la détection fluorimétrique induite par laser, dont les limites de détection sont beaucoup plus basses que celles obtenues en détection UV classique. Cette détection fluorimétrique requière, la plupart du temps, une étape de dérivation. En effet, peu de molécules possèdent, à l'état natif, un fluorophore qui peut être excité avec les sources laser conventionnelles émettant dans le domaine du visible. Malheureusement, cette étape de dérivation peut s'avérer délicate, notamment, du fait de la faible quantité d'échantillon disponible. Pour pallier ce problème, quelques lasers émettant dans la gamme UV ont été récemment commercialisés. Ceux-ci ouvrent de nouvelles potentialités en termes de détection d'une grande variété de composés qui possèdent, à l'état natif, un fluorophore excitable en UV. Dans ces travaux, nous avons étudié les potentialités d'un nouveau détecteur de fluorescence native induite par un laser émettant à 224 nm. En Electrophorèse Capillaire, nous avons réalisé au laboratoire un montage expérimental original permettant, sur une même analyse, de détecter successivement les solutés analysés par absorption UV et par fluorescence à 224 nm. Dans cette configuration, nous avons pu démontrer que la fluorescence induite à 224 nm permettait, dans le cas de l'ibuprofène, de gagner un facteur 500 en termes de limite de détection. Dans le cas de la nano-LC, nous avons analysé les peptides issus d'une digestion trypsique du cytochrome C en recourant à la détection par fluorescence à basse longueur d'onde. Les résultats obtenus ont été comparés à ceux provenant d'une détection UV classique. Ainsi, bien qu'actuellement, la cellule de détection ne soit pas adaptée au capillaire utilisé en raison de son très faible diamètre interne (d.i. = 20 µm) les résultats obtenus semblent prometteurs surtout si l'on considère la prochaine disponibilité d'une nouvelle cellule de détection adaptée au capillaire de très faible diamètre interne.