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Theses Year : 2019

Study of the role of G proteins in high grade gliomas: involvement in migration and the mesenchymal phenotype

Etude du rôle des protéines G dans les gliomes de haut grade : implication dans la migration et le phénotype mésenchymateux


GBM is the most common (∼45% of all gliomas) and aggressive primary malignant brain tumor in adults. As described in this document's introduction, GBM highly heterogeneous phonotype associated with molecular signatures and gene expressions, but also with hypoxic and inflammatory microenvironmental conditions, contribute to frequent recurrence after complete resection-radio/chemotherapy, and explain the multiple therapeutic failures. Most of the current treatment options for GBM, although sometimes multimodal, the survival of GBM patients is not significantly improved, and the challenges to improve patient survival and quality of life remain enormous. Thus, the identification of differentially expressed factors that could better define the biological behavior of GBM, would provide a basis for the development of novel therapies and may be more effective. One of the characteristics of GBMs is their highly migratory and invasive properties, relayed mainly by chemotactic factors belonging to the hypoxic and inflammatory tumor microenvironment. G-protein coupled receptors (GPCRs) and their ligands, particularly the chemokines GPCRs, overexpressed in GBMs and stimulating migration, invasion and neoangiogenesis, play a key role in the development of GBM and the acquisition of an aggressive phenotype. In this context, our team demonstrated that UT, the receptor of urotensin II (UII), a pro-angiogenic and pro-inflammatory chemokine, as well as the well-known chemokine system SDF-1/CXCR4 are systematically co-expressed in GBMs particularly in vascular and perinecrotic areas and their expression are correlated with grade. We also demonstrated in vitro that UII/UT stimulate GBM cells chemotactic migration and invasion via activation of the pathways Gαi/PI3K and Gα13/Rho/ROCK, pathways that have previously been identified for the SDF-1α/CXCR4 system and other chemotactic GPCRs. In addition, a recent principal component analysis of TCGA (The Cancer Genome Atlas) database performed by Alexandre Mutel, PhD student in the team, has identified the expression signature of GPCRs in gliomas and particularly those which are overexpressed in mesenchymal GBM, among which many chemotactic GPCRs are included. Taking together, their redundant expression and signaling activity frequently associated with tumorigenesis, particularly in GBMs, raises the issue of studying signaling nodes common to all these GPCRs. These nodes, are primarily represented by heterotrimeric G proteins, composed of α, β and γ subunits, that couple these GPCRs relaying many intracellular secondary effectors, probably essentials in the regulation of GBM aggressiveness. In this context, the aim of my thesis work was to identify the main Ga, b and g subunits among the 31 G proteins expressed in human gliomas and those more specifically associated with the malignant grade, and the aggressiveness of GBMs and then to determine the role of one of these specific G proteins in GBM cells proliferation and invasion mechanisms. For that, we first analyzed the expression of the 31 subunits (15α, 5β and 11γ) of G proteins from the TCGA database and showed that the mRNA expression of Gαz, Gαi1, Gβ4, Gβ5 et Gγ3 are relatively low in GBMs while Gα12, Gα13, Gα15, Gαi2, Gαi3, Gβ2, Gγ5, Gγ11 and Gγ12 subunits, are particularly overexpressed in GBM and are associated with a poor prognosis in terms of recurrence and patient survival. We then confirmed by RT-qPCR the high expression of these interesting identified G proteins by analyzing their expression in 6 different glioma cell lines as well as in GBM patient biopsies obtained in collaboration with the pathology department of Rouen University Hospital (Collaboration Pr A. Laquerrère). TCGA database analysis associated with the clinical information of patients indicate that these subunits are all associated with a poor prognosis for glioma patient survival. Moreover, the downregulation of Gα15, Gαi3 or Gβ2 in U87 GBM cell lines significantly decrease the cells proliferation/survival, adhesion associated with migration. Thus, we propose these identified G proteins (Gα15, Gαi3, Gβ2, Gγ5, Gγ10, Gγ11 and Gγ12) as GBM malignancy biomarkers and they could contribute to the GBM aggressive phenotype. Among all the identified G proteins, we specifically focused on Gα15, an atypical and non-ubiquitous G protein long described to be specific to hematopoietic stem cell. The latter seems to be also expressed de novo in highgrade gliomas, more particularly in neural and mesenchymal GBMs. Thus, we investigated whether the expression of this Gα15 subunit in GBM cells, controls the mechanisms of proliferation/invasion and is a potential therapeutic target. To better analyze the function of Gα15, we used siRNA, shRNA or Crispr-Cas9 technology to stably inactivate GNA15 (Gα15-KO) gene in U87 and 8MG cell lines. From these cells, we have demonstrated that Gα15 silencing or knockout significantly decreases the number (nucleocounter counting) and viability of GBM cells (measure of cells metabolic activity determined by WST-1 cleavage). These findings demonstrated that Gα15 is an important G protein implicated in cell survival, without affecting the cell cycle, in the absence of GPCR activation. GBM is also characterized by its highly invasive behavior. This behavior in GBM is one of the hallmarks that contribute to tumor recurrence and poor prognosis of GBM. Tumor cell migration and invasion is a coordinated multi-step process including the dynamic reorganization of the actin cytoskeleton, membrane protrusions like lamellipodia, formation of adhesion complexes, cell body contraction, and tail detachment for mesenchymal migration. In this context we have demonstrated that the repression of Gα15 expression significantly decreases the number of migrated GBM cells in transwell migration and wound healing assays, while its overexpression has opposite effects. Interestingly, using videomicroscopy for timelapse recordings of cell motility, we observed that U87 control cells emits lamellipodia in the front of the cells to migrate whereas Gα15-KO clones failed to be polarized, exhibited a reduced trajectory length associated with average speed as well as cumulative distances significantly lowered compared with U87 control cells. Immunocytochemistry analysis revealed that the inactivation of Gα15 significantly reduces the number of focal adhesion complex (FA) rich in Phospho-paxillin and vinculin (two major proteins of FA), and impairs actin cytoskeleton remodeling (actin stress fibers polymerization) associated with a significant decrease of wellformed lamellipodia number. However, Gα15 overexpressing cells exhibit an exacerbation of both FA proteins and lamellipodia number. These observations show that Gα15 plays a major role in the regulation of migration/invasion and survival associated with GBMs growth. In order to identify the main Gα15-regulated signaling pathways to stimulate these processes, we analyzed the oncogenic signaling pathways by western blot and identified that Gα15 inactivation significantly inhibits the activation of ERK1/2 pathway, critically reduces the expression of STAT3, Akt and β-catenin. In addition, analysis of mRNA expression level of three main effectors of Gα15 (PLCβ1, PLCβ2 and TPR1) revealed only a significant decreased expression of PLCβ2 in Gα15-KO cells, suggesting a common mechanism between PLCβ2 and Gα15 in GBMs. In agreement with these data we hypothesized that Gα15 (1) stimulates at least ERK and STAT3 activation via PLCβ2/PKC pathway promoting high proliferation/survival of GBM cells, (2) stimulates PI3K/Akt pathway resulting in the expression and/or activation of NF-κB and β-catenin to regulate numerous aggressive gene expression, (3) probably regulates the actin polymerization through PLCβ2 and stimulates intracellular signaling pathways (ERK, Akt…) associated with adhesion protein paxillin and vinculin. To further understand whether gliomas aggressiveness regulated by Gα15 is associated to the regulation of mesenchymal transition, we analyzed by RT-qPCR or immunocytochemistry and demonstrated that Gα15 knockout in GBM cells is sufficient to significantly decrease (1) the mRNA expression of several mesenchymal transcription factors (TFs) including C/EBPβ, RUNX1, FOSL2, BHLHB2, ZEB1, N-cadherin membrane translocation, (2) pro-angiogenic markers (Angiogenin and VEGFA), (3) the expression of inflammatory marker SERPINA1 and a stemness TF KLF4. However, the mRNA expression of potential tumor repressors (DKK1, ZNF238) as well as the stemness gene SOX2 which is a key activator of DKK1 pathway, were significantly decreased in Gα15-KO cells. Collectively, these results highlight the essential role of Gα15 in the expression of oncogenic markers as well as in the acquisition of glioma mesenchymal phenotype, promoting the establishment of immunosuppressive and angiogenic microenvironment supporting GBM aggressiveness. Finally, to evaluate the importance of Gα15 in the growth and invasiveness of GBMs in vivo, orthotopic xenografts of U87 controls, two U87 Gα15-KO clones and U87 overexpressing Gα15 were performed in Nude mice, intrastrially. Our results show a significant improved survival of mice when Gα15 is knockout (prolongs the median survival to 60 and 84 days for KO 26-1 (p=0,0436) and 26-6 (p=0,0016) respectively vs 44 days for the control), and its overexpressing cells xenografted in Nude mice exhibit the poorest survival rates (50 days vs 61 days for the control, p = 0,0326). These results strongly suggest that Gα15 subunit is involved in GBM aggressiveness in vivo. In conclusion, our results show that Gα15 expression is sufficient to maintain the survival, to stimulate the migration of GBM cells, and to promote the expression or activation of factors involved in the mesenchymal transition, angiogenesis, stemness and inflammation status. Although additional experiments are needed to confirm the pathways and mechanisms associated with Gα15, these original works open important perspectives on the diagnostic potential of Gα15 for mesenchymal and inflammatory GBMs, and therapeutics to target the most invasive and resistant GBMs.
Représentant environ 45% de tous les gliomes, le GBM est la tumeur cérébrale la plus agressive chez l’adulte. Comme nous l’avons décrit dans l’introduction de ce manuscrit, le caractère très hétérogène du GBM associé aux signatures moléculaires et expressions géniques, mais également aux conditions microenvironnementales hypoxique et inflammatoire, contribuent à la récidive quasi-systématique après exérèse complète-radio/chimiothérapie, et expliquent les nombreux échecs thérapeutiques. Malgré l’arsenal thérapeutique potentiellement disponible, appliqué parfois de manière multimodale, la survie des patients atteints de GBM n’est pas significativement améliorée, les défis à relever pour améliorer cette survie et la qualité de vie des patients restent énormes. Ainsi, l'identification de facteurs exprimés de manière différentielle qui pourraient mieux définir le comportement agressif des cellules de GBM fournirait une base pour le développement de thérapies innovantes et peut-être plus efficaces. Une des caractéristiques des GBMs est leur capacité très migratoire et invasive, relayées principalement par des facteurs chimiotactiques dans un microenvironnement tumoral hypoxique et inflammatoire. Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) et leurs ligands, particulièrement les RCPGs de chimiokines, surexprimés dans les GBMs et stimulant la migration chimiotactique, l’invasion et l’angiogenèse jouent un rôle majeur dans le développement des GBMs et l'acquisition d'un phénotype agressif. Dans ce contexte, notre équipe avait démontré que le récepteur UT de l’urotensine II (UII), une chimiokine peptidique pro-angiogénique et pro-inflammatoire, ainsi que le système chimiokine bien connu SDF- 1a/CXCR4 semblent systématiquement co-exprimés dans les GBMs, plus spécifiquement dans les zones vasculaires et périnécrotiques, montrant une corrélation avec le grade des gliomes. In vitro, nous avions aussi établi que l’UII/UT stimule la migration chimiotactique des cellules de GBM via les couplages de type Gαi/PI3K et Gα13/Rho/ROCK, des couplages précédemment mis en évidence pour le système SDF-1α/CXCR4 et d’autres RCPGs chimiotactiques. De plus, une récente analyse de la base de données TCGA (The Cancer Genome Atlas) en composante principale réalisée par Alexandre Mutel, étudiant en thèse dans l’équipe, a permis d’identifier la signature d’expression des RCPGs exprimés dans les gliomes et particulièrement dans les GBMs, qui révèle un nombre très important de RCPGs chimiotactiques. Dans l’ensemble, leur expression et activité signalisante redondantes fréquemment associées à la tumorigenèse, en particulier dans les GBMs, soulignent l’intérêt d’étudier les noeuds de signalisation communs à l’ensemble de ces RCPGs chimiokines. Ces noeuds sont principalement représentés par les protéines G hétérotrimériques composées des sous-unité α, β et γ, qui couplent ces RCPGs et relayent les effecteurs secondaires intracellulaires, probablement essentiels à la régulation de l’agressivité des GBMs. Ainsi, l’objectif de mon travail de thèse était d’identifier les principales protéines Ga, b et g parmi les 31 protéines G exprimées chez l’Homme dans les gliomes et celles plus spécifiquement associées au degré de malignité, et à l’agressivité des GBMs puis à déterminer le rôle d’une de ces protéines G dans les mécanismes de prolifération et d’invasion de cellules de GBM. Dans un premier temps, nous avons analysé l’expression des 31 sous-unités (15α, 5β et 11γ) de protéines G sur la base de données transcriptomiques du The Cancer Genome Atlas (TCGA), et démontré que les niveaux d'ARNm codant pour les sous-unités Gαz, Gαi1, Gβ4, Gβ5 et Gγ3 sont relativement faibles dans les GBMs tandis que les sous-unités Gα12, Gα13, Gα15, Gαi2, Gαi3, Gβ2, Gγ5, Gγ11 et Gγ12 sont particulièrement surexprimées dans les GBMs et sont associées à un mauvais pronostic en termes de récidive et de survie du patient. Nous avons ensuite confirmé par qPCR que les protéines G identifiées sont bien exprimées dans des prélèvements de GBMs de patients obtenus en collaboration avec le service d’anatomopathologie du CHU de Rouen (Collaboration Pr A. Laquerrère) ainsi que dans 6 lignées cellulaires de gliome. Les analyses des données du TCGA associées aux informations cliniques des patients indiquent que ces sous-unités sont toutes associées à un mauvais pronostic de survie chez les patients atteints de gliome. Aussi, l’inhibition de l’expression des sous-unités Gα15, Gαi3 ou Gβ2 dans la lignée de GBM U87 entraîne une diminution de la prolifération/survie et des adhésions associées à la migration cellulaire. Ainsi, nous proposons que les protéines identifiées (Gα15, Gαi3, Gβ2, Gγ5, Gγ10, Gγ11 et Gγ12) représentent des marqueurs de malignité des GBMs ; et contribuent au phénotype agressif d’invasivité des GBMs. Parmi ces protéines Gα, β ou γ identifiées, nous nous sommes focalisés plus particulièrement sur Gα15, une sous-unité atypique non ubiquiste longtemps décrite comme spécifique aux cellules souches hématopoïétiques. Cette dernière semble également être exprimée de novo dans les gliomes de haut-grade, et plus particulièrement dans les GBMs neuraux et mésenchymateux. Ainsi, nous avons recherché si l’expression de cette sous-unité Gα15 dans des cellules de GBM, contrôle les mécanismes de prolifération et d’invasivité et constitue une potentielle cible thérapeutique. Pour mieux analyser la fonction de Gα15, nous avons utilisé la technologie siRNA, shRNA ou CRISPR-Cas9 pour inhiber l’expression ou inactiver de manière stable le gène GNA15 (Gα15-KO) dans les lignées cellulaires de GBM U87 et 8MG. A partir de ces cellules, nous avons démontré que la sous-expression de Gα15 ou son inactivation réduit significativement le nombre de cellules (comptage au Nucleocounter) ainsi que la viabilité des cellules de GBM (mesure de l'activité métabolique des cellules déterminée par le clivage WST-1). Ces résultats démontrent que Gα15 est une protéine G impliquée dans la survie des cellules de GBM, mais ne modifie pas le cycle cellulaire, et ce en l’absence d’activation d’un RCPG. Le GBM se caractérise aussi par son comportement fortement invasif. Ce comportement est l'une des caractéristiques qui contribuent à la récurrence et au mauvais pronostic des GBMs. La migration et l'invasion des cellules tumorales est un processus coordonné en plusieurs étapes comprenant la réorganisation dynamique du cytosquelette d'actine, des protrusions membranaires comme les lamellipodes, la formation de complexes d’adhésion, la contraction du corps cellulaire et le détachement de la queue cellulaire pour la migration mésenchymateuse. Dans ce contexte nous avons démontré que la répression de l’expression de Gα15 diminue significativement la migration des cellules de GBM dans les tests de migration en transwell et de wound healing, alors que sa surexpression favorise la migration. En évaluant la motilité cellulaire par vidéomicroscopie, nous observons que les cellules contrôles U87 émettent des lamellipodes orientées pour migrer, alors que les cellules clonales Gα15-KO ne sont pas polarisées et montrent une diminution significative de la longueur des trajectoires parcourues associée à une vitesse moyenne de déplacement réduite par rapport aux cellules U87. Les études d’immunocytochimie révèlent que l’inactivation de Gα15 entraîne une réduction significative du nombre de complexes d’adhésion focal (FA) riches en Phospho-paxillin et en vinculine (deux protéines majeures des FA), et altère le remodelage du cytosquelette d’actine (polymérisation des fibres de stress d’actine) associé à une diminution significative de l’émission des lamellipodes. Au contraire, les cellules sur-exprimant Gα15 présentent une exacerbation de la concentration des protéines formant le complexe FA et du nombre de lamellipodes. Ces observations montrent que Gα15 joue un rôle majeur dans la régulation de la migration/invasion et la survie associées à la croissance des GBMs. Afin d’identifier les principales voies de signalisation régulées par Gα15 pour stimuler ces processus, nous avons analysé par Western blot les voies de signalisation oncogénique et identifié que l’inactivation de Gα15 inhibe significativement la voie ERK1/2, réduit considérablement l’expression de STAT3, de Akt et de la β-caténine. De plus, l'analyse du niveau d'expression de l'ARNm codant trois effecteurs principaux de Gα15 (PLCβ1, PLCβ2 et TPR1) a révélé une diminution significative de l'expression de PLCβ2 dans les cellules U87 Gα15-KO, suggérant un mécanisme commun entre PLCβ2 et Gα15 dans les GBMs. Ces données permettent de proposer que Gα15 (1) stimule au moins l’activation de ERK1/2 et STAT3 via la voie PLCβ2/PKC favorisant une haute survie/prolifération des cellules de GBM, (2) favorise la voie PI3K/Akt aboutissant à l’expression et/ou l’activation de NF-κB et de la β- caténine pour réguler l'expression de nombreux gènes pro-tumorigène, et (3) peut réguler la polymérisation d’actine dépendante de PLCβ2 et stimuler les voies de signalisation intracellulaires (ERK, Akt,…) associées aux protéines d’adhésions paxilline et vinculine. Pour mieux comprendre si l'agressivité des gliomes favorisée par Gα15 est associée à la régulation de la transition mésenchymateuse, nos études de qPCR ou immunocytochimiques montrent que l’inactivation de Gα15 dans les cellules de GBM est suffisante pour diminuer de manière significative l’expression (1) des ARNm des facteurs de transcription (TFs) mésenchymateux incluant C/EBPβ, RUNX1, FOSL2, BHLHB2, ZEB1, et la translocation membranaire de N-cadhérine, (2) de marqueurs pro-angiogéniques (Angiogénine et VEGFA) et (3) de la SERPINA1 pro-inflammatoire et du TF KLF4 marqueur de cellules souches. En revanche, l'expression des ARNm de répresseurs tumoraux (DKK1, ZNF238) ainsi que du marqueur de cellules souches SOX2 activateurs de la voie DKK1, est significativement inhibée dans les cellules Gα15-KO. Ensemble, ces résultats mettent en évidence le rôle essentiel de Gα15 dans l’expression marqueurs oncogénique ainsi que dans l’acquisition du phénotype mésenchymateux des gliomes, permettant la mise en place d’un microenvironnement tumoral immunosuppresseur et angiogénique soutenant l'agressivité des GBMs. Enfin, pour évaluer l’importance de Gα15 dans la croissance et l’invasivité des GBMs in vivo, des xénogreffes orthotopiques des U87 contrôles, de deux clones U87 Gα15-KO ainsi que des U87 sur-exprimant Gα15 ont été réalisés chez la souris Nude, dans le striatum. Nos résultats montrent une survie significativement améliorée des souris lorsque Gα15 est inactivée (survie médiane de 60 et 84 jours pour les clones KO 26-1 (p=0,0436) et KO 26-6 (p=0,0016) respectivement contre 44 jours pour les U87, et une survie réduite des souris Nude xénogreffées par les cellules sur-exprimant Gα15 (50 jours contre 61 jours pour le contrôle, p=0,0326). Ces résultats démontrent que la sous-unité Gα15 est une protéine impliquée dans l’agressivité des GBMs in vivo. En conclusion, nos résultats montrent que l’expression de Gα15 est suffisante pour maintenir la survie et entraîner la migration des cellules de GBM, et favorise l’expression ou l’activation de facteurs impliqués dans la transition mésenchymateuse, l’angiogenèse, le statut souche et l’inflammation. Bien que des expériences complémentaires s’avèrent nécessaires pour confirmer les voies et mécanismes associés à Gα15, ces travaux originaux ouvrent des pistes et perspectives sur le potentiel diagnostique de Gα15 pour les GBM mésenchymateux et inflammatoire, et thérapeutique pour cibler les GBMs les plus invasifs et résistants.
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Kleouforo Paul Dembele. Etude du rôle des protéines G dans les gliomes de haut grade : implication dans la migration et le phénotype mésenchymateux. Cancer. Université Rouen Normandie, 2019. Français. ⟨NNT : ⟩. ⟨tel-02435413⟩
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