Filamin A, a central actor relaying the invasion mechanisms of high-grade gliomas: involvement in the signaling and trafficking of the chemotactic urotensin II receptor
La Filamine A, acteur central relayant les mécanismes d'invasion des gliomes de haut-grade : implication dans la signalisation et le trafic du récepteur chimiotactique de l'urotensine II
Résumé
Multiform glioblastoma (GBM) are the most frequent and aggressive tumor of the central
nervous system (CNS). The standard treatment therapy for GBM follows the “Stupp protocol”
consisting in the most complete surgical resection combined with radio/chemotherapy with
temozolomide (TMZ). Despite this heavy first line treatment, patients with GBM display a
survival median of only 14.6 months. Even if the resection as large as possible, the diffuse
properties of GBM cells leads to a quasi-systematic invasion of the margin of the resection
cavity. The healthy brain parenchyma invasion by GBM cells, in margin or at distance of the
resection cavity, constitutes a main therapeutic issue. These invasion mechanisms are carried
by cell transformations caused by the microenvironment such as hypoxia and angiogenesis
responsible for mesenchymal transition (MT) mainly controlled by two transcription factors
STAT3 and CEBPα which stimulate 70% of secondary mesenchymal genes. Hypoxia
associated with MT triggers the expression of chemokine G protein-coupled receptor (GPCRs).
The most studied chemotactic GPCR in GBM is CXCR4 which mediates promigratory effects
through Gαi/PI3K/PIP3 and Gα13/Rho/ROCK as well as its endocytosis and recycling mediated
by β-arrestins. Our team already demonstrated that the UT receptor of the neuropeptide
urotensin II (UII) behaves like a chemokine receptor and stimulates GBM directional migration
by Gαi/PI3K/PIP3 and Gα13/Rho/ROCK allowing cell polarization, lamellipodia formation,
actin stress fiber polymerization and cell contraction. Thus it appears that the expression and
coupling redundancy of chemotactic GPCRs constitute a major brake for the development of
targeted therapy against these systems. Based on these observations, we proposed to identify
new protein partners common to these chemokine GPCRs which could then be targeted by
future anti-invasive therapies.
First, we validated the systematic redundancy of expression of CXCR4/SDF-1α and UT/UII
systems by immunohistochemical studies carried in various patient glioma grades
(Collaboration with Pr A. Laquerrière, CHU Rouen Hospital). These systems are more strongly
co-expressed in pseudopalisadic peri-necrotic hypoxic GBM areas.
In order to identify whether this interaction between FlnA and UT could exert a functional
impact in GBM activity, we evaluated the FlnA mRNA expression levels by means of RNAseq
data from The Cancer Genome Atlas (TCGA) and IVYgap (IVY glioblastoma atlas project)
data bases. These analyses highlighted that FlnA expression levels are correlated with glioma
grades, showing the highest levels in IDH1/2 (Isocitrate Dehydrogenase 1 & 2) wild type
mesenchymal GBM. FlnA overexpression is shown associated with a decrease of overall
survival and earlier recurrence. Moreover IVYgap data analysis combined with
immunolabelings performed on glioma patient samples, revealed that is strongly express in
pseudopalisades and hypoxic areas as well as in microvascular proliferation areas. Additional
analysis FlnA-associated ontological gene networks based on genes which expression is the
most correlated with FlnA in glioma, stressed main networks associated with PI3K pathway,
cell polarization and adhesion or cytoskeleton regulation.
In order to study FlnA intrinsic properties in GBM activity, FlnA expression levels were first
confirmed in GBM cell lines under normoxia and hypoxia. Hypoxia triggered FlnA mRNA
overexpression as well as increased FlnA and UT protein forms. We generated from the U87
GBM cell line, a KnockOut (KO) U87 cell line deleted for the gene encoding FlnA by using
the CRISPR/Cas9 technology. FlnA deletion in U87 cells is associated with a significant
decrease of their proliferative capacities, a mechanism characterized by cell accumulation in
G1 cell cycle phase, suggesting a slow progression towards S phase and accumulation in
senescence. Moreover, FlnA depletion was shown to sensitize U87 cells to TMZ and
Irininotecan (CPT-11) tested at low concentrations (10-7M of each). Regarding motility, U87
cells displayed spontaneous production of lamellipodia, actin stress fibers and focal adhesion
points, responsible for “mesenchymal endogenous” migration. However, FlnAKO cells
exhibited a significant decrease of their motility associated with a reduction of focal adhesion
points labeled by an anti phospho_paxillin antibody, associated with a major inhibition of actin
stress fiber polymerization. The quantification of the number and the type of membrane
protrusions on the two cell lines indicated that U87-FlnAKO are unable to generate and stabilize
lamellipodia. These observations show that FlnA is essential for actin stress fiber
polymerization, lamellipodia formation and focal adhesion maturation essential for chemotactic
directional migration.
Previous work of our team demonstrated that UT receptor mediates glioma chemotactic
migration through Gαi/PI3K/PIP3 and Gα13/Rho/ROCK allowing lamellipodia expansion and
vinculin focal adhesion maturation. In this study we showed that the absence of FlnA prevents
adhesion/de-adhesion cycles stimulated by the UII (10-8M)-induced UT activation, as well as
the directional migration in response to UII (10-12 M, 10-9 M and 10-7 M) in the Boyden chamber
assay. This strongly suggests that FlnA may control GPCR-dependent chemotactic migration
in general and UT in particular.
We next investigated whether this interaction would play a role in UT couplings and
trafficking. In the presence of FlnA, U87 cells expressing recombinant UT-eYFP uncoupled to
Gαq, but precoupled within lamellipodia with Gαi , while this colocalization increased within
the cytosol after UII treatment. In U87-FlnAKO cells, this Gαi precoupling was not found but
UT appeared mainly colocalized with Gαq mainly after UII treatment. This new coupling
acquisition was confirmed by specific calcium mobilization after UII treatment in U87-FlnAKO
cells. Thus, FlnA seems essential for UT precoupling to Gαi and Gαq exclusion in GBM cells.
During a sustain activation, UT receptor is present in membrane ruffles of U87 cells and could
be internalized and endocytate after UII treatment (10-7M and 10-9M). These membrane ruffles
are absent in FlnAKO cells and UT was expressed at the plasma membrane even after sustained
UII treatment. We conclude here that FlnA plays a key role in the transport regulation of UT to
the lamellipodia through ruffles expansion and in UT internalization/endocytosis process.
Reciprocally, we demonstrated that UT activation in U87 cells triggered FlnA cleavage
characterized by the detection of FlnA band at 110-130 kDa in Western blot, associated with a
UT relocalization at the plasma membrane. These mechanisms are inhibited in presence of
pertussis toxin (PTX) which inhibits Gαi activity while cells still emitted lamellipodia possibly
via free complexes allowing PI3K activation. Results of the receptor distribution
quantification suggested that receptor relocation after stimulation is dependent on Gαi activity,
PKA inhibition that would favor calpains activity to induce FlnA proteolysis and UT
redistribution after UII stimulation.
Finally, we performed orthotropic U87 and U87-FlnAKO cells xenograft in the striatum of
NMRI/Nude mice. We observed a significant survival improvement of U87-FlnAKO injected
mice compared with control mice injected with U87 cells. Immunolabelings performed on brain
tumor slices obtained from sampled injected mouse brains at 15 days post-injection, showed a
drastic modification of the U87-FlnAKO tumor phenotype. Indeed, U87-GBM displayed a
necrotic tumor core associated with a highly invasive phenotype, sometimes multifocal with
strong and intense FlnA and MMP-9 labelings, showings colocalisation between FlnA and UT
in invasive processes, around UII-expressing components. U87-FlnAKO GBM rather exhibited
a highly circumscribe phenotype accompanied by the loss of FlnA, UT and MMP-9 expression
as well as by occurrence of a normal vascularization. However the CD44 labeling was not
modified in the presence or the absence of FlnA in U87 GBM cells, suggesting that FlnA
deletion is not controlling expression all mesenchymal markers, but rather represses
downstream GBM invasive properties.
Altogether these data show that FlnA plays a major role in proliferation and adhesion
processes in GBM cells. Moreover, FlnA directly controls UT receptor signalings by
conditioning in one hand its precoupling to Gαi and on the other hand by allowing its rapid and
dynamic internalization/endocytosis and its recycling to the lamellipodia. Thus it is possible to
develop therapeutic strategies specifically targeting FlnA/UT interaction in order to prevent
healthy brain invasion mediated by UT, and more generally, by all chemokine receptors
interacting with FlnA.
Les glioblastomes multiformes (GBM) sont les tumeurs les plus fréquentes et agressives du
système nerveux central. Le traitement standard des GBM suit le « Protocole de Stupp » qui
consiste en une résection chirurgicale de la tumeur la plus large possible, suivie d’une
radiothérapie/chimiothérapie au temozolomide (TMZ) concomitante. Malgré ce traitement
lourd de première ligne, les patients atteints de GBM présentent une survie médiane de
seulement 14,6 mois. Même si la résection semble la plus complète possible, le caractère diffus
et invasif des cellules de GBM est à l’origine de récidives quasi-systématiques en bordure de la
cavité de résection. L’invasion du parenchyme cérébrale sain par les cellules de GBM, en
bordure ou à distance de la zone de résection, constitue par conséquent un enjeu thérapeutique
majeur. Ces mécanismes d’invasion sont portés par des transformations cellulaires liées aux
contraintes environnementales telles que l’hypoxie et l’angiogenèse, responsables d’une
transition mésenchymateuse (TM) principalement contrôlée par les facteurs de transcriptions
STAT3 et CEBP qui stimulent 70% des gènes secondaires mésenchymateux. L’hypoxie
associée à la TM entraînent notamment la surexpression de récepteurs à 7 domaines
transmembranaires couplés aux protéines G (RCPGs) de chimiokines, entres autres. Le RCPG
chimiotactique le plus largement étudié dans le GBM est le CXCR4 relayant ses effets pro
migratoires via les couplages et les voies Gαi/PI3K/PIP3 et Gα12/13/Rho/ROCK ainsi que son
endocytose clathrine-dépendante et le recyclage relayé par l’activité de β-arrestines. Des
travaux déjà réalisés dans notre équipe ont aussi pu mettre en évidence que le récepteur UT du
neuropeptide urotensine II (UII) se comporte comme un récepteur de chimiokine pouvant
stimuler la migration directionnelle de cellules de GBM via l’activation séquentielle de
Gαi/PI3K/PIP3 puis de Gα12/13/Rho/ROCK permettant la polarisation cellulaire, l’émission de
lamellipodes, la polymérisation des fibres de stress d’actine, et la contraction cellulaire. Ainsi
il apparait que la redondance d’expression et de couplages des RCPGs chimiotactiques
constitue un verrou majeur en termes de ciblage thérapeutique de l’un de ces systèmes. C’est
sur la base de ces observations que nous avons entrepris d’isoler de nouveaux partenaires
protéiques communs à ces récepteurs pouvant être la source de développement de nouvelles
stratégies anti-invasives.
Dans un premier temps, nous avons validé la redondance d’expression systématique des
systèmes CXCR4/SDF-1α et UT/UII par immunomarquages réalisés sur des prélèvements de
différents grades de gliome de patients (Collaboration avec Pr A. Laquerrière, CHU Rouen).
Ces systèmes sont plus particulièrement co-surexprimés dans les régions hypoxiques
pseudopalissadiques péri-nécrotiques des GBM.
Afin d’identifier si une telle interaction entre le récepteur UT et la FlnA peut constituer un
mécanisme fonctionnel dans l’activité des GBM, nous avons évalué les niveaux d’expression
de la FlnA à l’aide des informations de RNAseq de la base de données du TCGA (The Cancer
Genome Atlas) et de IVYgap (IVY glioblastome atlas project). Ces analyses de données bioinformatiques
nous ont permis de mettre en évidence que les niveaux d’expressions de FlnA
sont corrélées aux grades des gliomes, montrant les niveaux les plus élevés dans les GBM
mésenchymateux au statut IDH1/2 (isocitrate déshydrogénase1/2) sauvage. La surexpression
de FlnA est associée à une diminution de la survie globale et une récidive plus précoce. De plus,
les études des données de la base IVYgap combinées aux immunomarquages réalisés sur les
prélèvements de gliomes de patients, mettent en évidence que la FlnA est très fortement
exprimée dans les régions hypoxiques et pseudopalissadiques ainsi que dans les régions de
prolifération microvasculaire. L’analyse de réseaux ontologiques réalisée à partir des données
de niveaux d’expression des gènes dont l’expression est corrélée à la FlnA dans les gliomes, a
révélée des réseaux associés à la voie PI3K, à la polarisation cellulaire, aux adhésions ou à la
régulation du cytosquelette.
Afin d’étudier les propriétés intrinsèques de la FlnA dans la régulation de l’activité des
cellules de GBM, les niveaux d’expression de FlnA ont été confirmés dans des lignées de GBM,
en conditions normoxiques et hypoxiques, cette dernière permettant l’augmentation
transcriptionnelle des ARNm codant la FlnA, et protéique de la FlnA et de l’UT. Nous avons à
partir de la lignée de GBM U87, généré une lignée KnockOut (KO) délétée du gène codant la
FlnA grâce au système CRISPR/Cas9. L’absence de FlnA dans la lignée U87, est associée à
une réduction des capacités prolifératives, un mécanisme associé à une accumulation de cellules
en phase G1 du cycle cellulaire, suggérant une faible progression des cellules vers la phase S et
l’augmentation de la senescence. De plus, la délétion de la FlnA sensibilise les cellules U87
aux chimiothérapies TMZ et d’Irinotecan (CPT-11) testées à faibles concentrations (10-7M,
chaque). En termes de motilité, les cellules U87 montrent spontanément la présence de
lamellipodes, de fibres de stress d’actine et de points focaux d’adhésion, responsables d’une
migration de type « mésenchymateuse endogène ». En revanche, les cellules FlnAKO
présentent une diminution significative de leur motilité associée à la réduction du nombre
d’adhésions focales marquées par un anti-Phospho_paxilline, ainsi qu’à une inhibition majeure
de la polymérisation des fibres de stress d’actine. La quantification du nombre et du type de
protrusions membranaires sur ces 2 lignées indique que les cellules U87-FlnAKO sont dans
l’incapacité de générer et de stabiliser des lamellipodes. Ces observations montrent que la FlnA
est essentielle pour la polymérisation des fibres de stress d’actine, formation de lamellipodes,
et la maturation des points focaux d’adhésion indispensables à la migration chimiotactique
directionnelle.
Les travaux précédant de l’équipe avaient montré que le récepteur UT relaye la migration
chimiotactique de gliome via l’activation de Gαi/PI3K/PIP3 et Gα12/13/Rho/ROCK permettant
l’expansion du lamellipode et la maturation de points focaux d’adhésion comportant la
vinculine. Dans la présente étude nous montrons que l’absence de FlnA prévient les cycles
d’adhésion/dé-adhésion provoquées par la stimulation de l’UT par l’UII (10-8M), ainsi que la
migration directionnelle en chambre de Boyden en réponse à des concentrations croissantes
d’UII (10-12 M, 10-9 M et 10-7 M), suggérant que la FlnA contrôle la migration chimiotactique
dépendante d’un RCPG tel que l’UT.
Nous avons ensuite recherché si la FlnA était impliquée dans les couplages du récepteur UT
et son trafic cellulaire. En présence de FlnA dans les cellules U87 exprimant le récepteur UTeYFP
recombinant, les données immunocytochimiques montrent que le récepteur UT n’est pas
associé à Gαq, mais est co-localisé voire précouplé à la protéine Gαi au lamellipode et que cette
co-localisation est augmentée au niveau intracellulaire après un traitement par l’UII. Dans les
cellules U87-FlnAKO, ce précouplage Gαi n’est pas retrouvé, alors que l’UT se trouve colocalisé
avec Gαq principalement après traitement par l’UII. Cette acquisition de couplage est
confirmée par la stimulation de la mobilisation calcique spécifiquement détectée dans les
cellules U87-FlnAKO traitées par des concentrations croissantes d’UII. Ainsi, la FlnA semble
essentielle au pré-couplage Gαi et l’exclusion du couplage Gαq dans les cellules de GBM. Lors
d’une activation plus prolongée, le récepteur l’UT, présent dans des ruffles membranaires
(ondulations de la membrane plasmique en préparation d’une expansion membranaire) des
cellules U87 et être internalisé/endocyté après traitement par l’UII (10-7M, 10-9M). Ces ruffles
membranaires sont absents dans les cellules U87-FlnAKO et l’UT est présent à la membrane
plasmique y compris après un traitement prolongé en présence d’UII, suggérant que la FlnA
joue un rôle central dans la régulation du transport au lamellipode et au processus
d’internalisation du récepteur UT. Réciproquement, nous avons aussi montré que l’activation
du récepteur UT entraîne dans les cellules U87 un clivage de la FlnA et une bande à 110-130
kDa détectée en Western blot, ainsi qu’une relocalisation du récepteur UT à la membrane
plasmique. Ces mécanismes sont bloqués en présence de pertussis toxine (PTX) qui inhibe
l’activité de Gαi, alors que les cellules émettent toujours de larges lamellipodes possiblement
grâce au complexe libéré et l’activation de PI3K. Les résultats obtenus lors des
quantifications de la distribution du récepteur dans les différents compartiments cellulaires
suggèrent donc que le clivage de la FlnA dépendant de la protéine Gi capable potentiellement
d’inhiber l’activité d’une PKA et de stimuler de fait les calpaïnes, est nécessaire à
l’accumulation du récepteur au lamellipode suite à une stimulation par l’UII.
Enfin, nous avons réalisé des xénogreffes orthotopiques des lignées U87 et U87-FlnAKO
dans des lignées de souris Nude/NMRI. Cette étude a permis de mettre en évidence une
amélioration significative de la survie des animaux xénogreffés au niveau striatal avec la lignée
U87-FlnAKO comparativement aux animaux contrôle. Des séries d’immunomarquages réalisés
sur des cerveaux d’animaux prélevés de manière précoces (15 jours), ont permis de mettre un
mettre en évidence une modification majeure du phénotype des GBM issus des cellules U87-
FlnAKO. En effet, les GBM-U87 présentent un coeur tumoral plutôt d’apparence nécrotique et
une morphologie hautement invasive, parfois multifocale, accompagnée d’un fort marquage de
la FlnA et MMP-9 (Matrix Metallopeptidase 9), montrant une co-localisation des marquages
UT et FlnA dans les processus invasifs et une angiogenèse anormale. A contrario, les GBMU87-
FlnAKO présentent un phénotype hautement circonscrit accompagné d’une perte des
marquages FlnA, UT et MMP-9, et d’une vascularisation plutôt normalisée. Cependant la
persistance de la détection du marqueur CD44 dans ces tumeurs suggère que l’absence de FlnA
n’impacte pas l’expression de tous les marqueurs mésenchymateux, mais réprime en aval les
capacités invasives des cellules U87.
L’ensemble de ces données montre que la FlnA joue un rôle majeur dans la régulation des
phénomènes de prolifération et d’adhésion liés à la migration des cellules de GBM. De plus la
FlnA contrôle directement la signalisation du récepteur UT en conditionnant d’une part son
précoulage à la protéine Gαi et d’autre part en permettant l’internalisation/endocytose
dynamique du récepteur après stimulation et son recyclage au lamellipode. Ainsi il est
envisageable de développer des stratégies thérapeutiques ciblant spécifiquement l’interaction
UT/FlnA afin de prévenir l’invasion du parenchyme sain relayée par l’activation de l’UT, mais
de manière plus générale, par l’ensemble des systèmes chimiokines interagissant avec la FlnA.
Origine : Fichiers produits par l'(les) auteur(s)
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