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Theses Year : 2019

Filamin A, a central actor relaying the invasion mechanisms of high-grade gliomas: involvement in the signaling and trafficking of the chemotactic urotensin II receptor

La Filamine A, acteur central relayant les mécanismes d'invasion des gliomes de haut-grade : implication dans la signalisation et le trafic du récepteur chimiotactique de l'urotensine II



Multiform glioblastoma (GBM) are the most frequent and aggressive tumor of the central nervous system (CNS). The standard treatment therapy for GBM follows the “Stupp protocol” consisting in the most complete surgical resection combined with radio/chemotherapy with temozolomide (TMZ). Despite this heavy first line treatment, patients with GBM display a survival median of only 14.6 months. Even if the resection as large as possible, the diffuse properties of GBM cells leads to a quasi-systematic invasion of the margin of the resection cavity. The healthy brain parenchyma invasion by GBM cells, in margin or at distance of the resection cavity, constitutes a main therapeutic issue. These invasion mechanisms are carried by cell transformations caused by the microenvironment such as hypoxia and angiogenesis responsible for mesenchymal transition (MT) mainly controlled by two transcription factors STAT3 and CEBPα which stimulate 70% of secondary mesenchymal genes. Hypoxia associated with MT triggers the expression of chemokine G protein-coupled receptor (GPCRs). The most studied chemotactic GPCR in GBM is CXCR4 which mediates promigratory effects through Gαi/PI3K/PIP3 and Gα13/Rho/ROCK as well as its endocytosis and recycling mediated by β-arrestins. Our team already demonstrated that the UT receptor of the neuropeptide urotensin II (UII) behaves like a chemokine receptor and stimulates GBM directional migration by Gαi/PI3K/PIP3 and Gα13/Rho/ROCK allowing cell polarization, lamellipodia formation, actin stress fiber polymerization and cell contraction. Thus it appears that the expression and coupling redundancy of chemotactic GPCRs constitute a major brake for the development of targeted therapy against these systems. Based on these observations, we proposed to identify new protein partners common to these chemokine GPCRs which could then be targeted by future anti-invasive therapies. First, we validated the systematic redundancy of expression of CXCR4/SDF-1α and UT/UII systems by immunohistochemical studies carried in various patient glioma grades (Collaboration with Pr A. Laquerrière, CHU Rouen Hospital). These systems are more strongly co-expressed in pseudopalisadic peri-necrotic hypoxic GBM areas. In order to identify whether this interaction between FlnA and UT could exert a functional impact in GBM activity, we evaluated the FlnA mRNA expression levels by means of RNAseq data from The Cancer Genome Atlas (TCGA) and IVYgap (IVY glioblastoma atlas project) data bases. These analyses highlighted that FlnA expression levels are correlated with glioma grades, showing the highest levels in IDH1/2 (Isocitrate Dehydrogenase 1 & 2) wild type mesenchymal GBM. FlnA overexpression is shown associated with a decrease of overall survival and earlier recurrence. Moreover IVYgap data analysis combined with immunolabelings performed on glioma patient samples, revealed that is strongly express in pseudopalisades and hypoxic areas as well as in microvascular proliferation areas. Additional analysis FlnA-associated ontological gene networks based on genes which expression is the most correlated with FlnA in glioma, stressed main networks associated with PI3K pathway, cell polarization and adhesion or cytoskeleton regulation. In order to study FlnA intrinsic properties in GBM activity, FlnA expression levels were first confirmed in GBM cell lines under normoxia and hypoxia. Hypoxia triggered FlnA mRNA overexpression as well as increased FlnA and UT protein forms. We generated from the U87 GBM cell line, a KnockOut (KO) U87 cell line deleted for the gene encoding FlnA by using the CRISPR/Cas9 technology. FlnA deletion in U87 cells is associated with a significant decrease of their proliferative capacities, a mechanism characterized by cell accumulation in G1 cell cycle phase, suggesting a slow progression towards S phase and accumulation in senescence. Moreover, FlnA depletion was shown to sensitize U87 cells to TMZ and Irininotecan (CPT-11) tested at low concentrations (10-7M of each). Regarding motility, U87 cells displayed spontaneous production of lamellipodia, actin stress fibers and focal adhesion points, responsible for “mesenchymal endogenous” migration. However, FlnAKO cells exhibited a significant decrease of their motility associated with a reduction of focal adhesion points labeled by an anti phospho_paxillin antibody, associated with a major inhibition of actin stress fiber polymerization. The quantification of the number and the type of membrane protrusions on the two cell lines indicated that U87-FlnAKO are unable to generate and stabilize lamellipodia. These observations show that FlnA is essential for actin stress fiber polymerization, lamellipodia formation and focal adhesion maturation essential for chemotactic directional migration. Previous work of our team demonstrated that UT receptor mediates glioma chemotactic migration through Gαi/PI3K/PIP3 and Gα13/Rho/ROCK allowing lamellipodia expansion and vinculin focal adhesion maturation. In this study we showed that the absence of FlnA prevents adhesion/de-adhesion cycles stimulated by the UII (10-8M)-induced UT activation, as well as the directional migration in response to UII (10-12 M, 10-9 M and 10-7 M) in the Boyden chamber assay. This strongly suggests that FlnA may control GPCR-dependent chemotactic migration in general and UT in particular. We next investigated whether this interaction would play a role in UT couplings and trafficking. In the presence of FlnA, U87 cells expressing recombinant UT-eYFP uncoupled to Gαq, but precoupled within lamellipodia with Gαi , while this colocalization increased within the cytosol after UII treatment. In U87-FlnAKO cells, this Gαi precoupling was not found but UT appeared mainly colocalized with Gαq mainly after UII treatment. This new coupling acquisition was confirmed by specific calcium mobilization after UII treatment in U87-FlnAKO cells. Thus, FlnA seems essential for UT precoupling to Gαi and Gαq exclusion in GBM cells. During a sustain activation, UT receptor is present in membrane ruffles of U87 cells and could be internalized and endocytate after UII treatment (10-7M and 10-9M). These membrane ruffles are absent in FlnAKO cells and UT was expressed at the plasma membrane even after sustained UII treatment. We conclude here that FlnA plays a key role in the transport regulation of UT to the lamellipodia through ruffles expansion and in UT internalization/endocytosis process. Reciprocally, we demonstrated that UT activation in U87 cells triggered FlnA cleavage characterized by the detection of FlnA band at 110-130 kDa in Western blot, associated with a UT relocalization at the plasma membrane. These mechanisms are inhibited in presence of pertussis toxin (PTX) which inhibits Gαi activity while cells still emitted lamellipodia possibly via free  complexes allowing PI3K activation. Results of the receptor distribution quantification suggested that receptor relocation after stimulation is dependent on Gαi activity, PKA inhibition that would favor calpains activity to induce FlnA proteolysis and UT redistribution after UII stimulation. Finally, we performed orthotropic U87 and U87-FlnAKO cells xenograft in the striatum of NMRI/Nude mice. We observed a significant survival improvement of U87-FlnAKO injected mice compared with control mice injected with U87 cells. Immunolabelings performed on brain tumor slices obtained from sampled injected mouse brains at 15 days post-injection, showed a drastic modification of the U87-FlnAKO tumor phenotype. Indeed, U87-GBM displayed a necrotic tumor core associated with a highly invasive phenotype, sometimes multifocal with strong and intense FlnA and MMP-9 labelings, showings colocalisation between FlnA and UT in invasive processes, around UII-expressing components. U87-FlnAKO GBM rather exhibited a highly circumscribe phenotype accompanied by the loss of FlnA, UT and MMP-9 expression as well as by occurrence of a normal vascularization. However the CD44 labeling was not modified in the presence or the absence of FlnA in U87 GBM cells, suggesting that FlnA deletion is not controlling expression all mesenchymal markers, but rather represses downstream GBM invasive properties. Altogether these data show that FlnA plays a major role in proliferation and adhesion processes in GBM cells. Moreover, FlnA directly controls UT receptor signalings by conditioning in one hand its precoupling to Gαi and on the other hand by allowing its rapid and dynamic internalization/endocytosis and its recycling to the lamellipodia. Thus it is possible to develop therapeutic strategies specifically targeting FlnA/UT interaction in order to prevent healthy brain invasion mediated by UT, and more generally, by all chemokine receptors interacting with FlnA.
Les glioblastomes multiformes (GBM) sont les tumeurs les plus fréquentes et agressives du système nerveux central. Le traitement standard des GBM suit le « Protocole de Stupp » qui consiste en une résection chirurgicale de la tumeur la plus large possible, suivie d’une radiothérapie/chimiothérapie au temozolomide (TMZ) concomitante. Malgré ce traitement lourd de première ligne, les patients atteints de GBM présentent une survie médiane de seulement 14,6 mois. Même si la résection semble la plus complète possible, le caractère diffus et invasif des cellules de GBM est à l’origine de récidives quasi-systématiques en bordure de la cavité de résection. L’invasion du parenchyme cérébrale sain par les cellules de GBM, en bordure ou à distance de la zone de résection, constitue par conséquent un enjeu thérapeutique majeur. Ces mécanismes d’invasion sont portés par des transformations cellulaires liées aux contraintes environnementales telles que l’hypoxie et l’angiogenèse, responsables d’une transition mésenchymateuse (TM) principalement contrôlée par les facteurs de transcriptions STAT3 et CEBP qui stimulent 70% des gènes secondaires mésenchymateux. L’hypoxie associée à la TM entraînent notamment la surexpression de récepteurs à 7 domaines transmembranaires couplés aux protéines G (RCPGs) de chimiokines, entres autres. Le RCPG chimiotactique le plus largement étudié dans le GBM est le CXCR4 relayant ses effets pro migratoires via les couplages et les voies Gαi/PI3K/PIP3 et Gα12/13/Rho/ROCK ainsi que son endocytose clathrine-dépendante et le recyclage relayé par l’activité de β-arrestines. Des travaux déjà réalisés dans notre équipe ont aussi pu mettre en évidence que le récepteur UT du neuropeptide urotensine II (UII) se comporte comme un récepteur de chimiokine pouvant stimuler la migration directionnelle de cellules de GBM via l’activation séquentielle de Gαi/PI3K/PIP3 puis de Gα12/13/Rho/ROCK permettant la polarisation cellulaire, l’émission de lamellipodes, la polymérisation des fibres de stress d’actine, et la contraction cellulaire. Ainsi il apparait que la redondance d’expression et de couplages des RCPGs chimiotactiques constitue un verrou majeur en termes de ciblage thérapeutique de l’un de ces systèmes. C’est sur la base de ces observations que nous avons entrepris d’isoler de nouveaux partenaires protéiques communs à ces récepteurs pouvant être la source de développement de nouvelles stratégies anti-invasives. Dans un premier temps, nous avons validé la redondance d’expression systématique des systèmes CXCR4/SDF-1α et UT/UII par immunomarquages réalisés sur des prélèvements de différents grades de gliome de patients (Collaboration avec Pr A. Laquerrière, CHU Rouen). Ces systèmes sont plus particulièrement co-surexprimés dans les régions hypoxiques pseudopalissadiques péri-nécrotiques des GBM. Afin d’identifier si une telle interaction entre le récepteur UT et la FlnA peut constituer un mécanisme fonctionnel dans l’activité des GBM, nous avons évalué les niveaux d’expression de la FlnA à l’aide des informations de RNAseq de la base de données du TCGA (The Cancer Genome Atlas) et de IVYgap (IVY glioblastome atlas project). Ces analyses de données bioinformatiques nous ont permis de mettre en évidence que les niveaux d’expressions de FlnA sont corrélées aux grades des gliomes, montrant les niveaux les plus élevés dans les GBM mésenchymateux au statut IDH1/2 (isocitrate déshydrogénase1/2) sauvage. La surexpression de FlnA est associée à une diminution de la survie globale et une récidive plus précoce. De plus, les études des données de la base IVYgap combinées aux immunomarquages réalisés sur les prélèvements de gliomes de patients, mettent en évidence que la FlnA est très fortement exprimée dans les régions hypoxiques et pseudopalissadiques ainsi que dans les régions de prolifération microvasculaire. L’analyse de réseaux ontologiques réalisée à partir des données de niveaux d’expression des gènes dont l’expression est corrélée à la FlnA dans les gliomes, a révélée des réseaux associés à la voie PI3K, à la polarisation cellulaire, aux adhésions ou à la régulation du cytosquelette. Afin d’étudier les propriétés intrinsèques de la FlnA dans la régulation de l’activité des cellules de GBM, les niveaux d’expression de FlnA ont été confirmés dans des lignées de GBM, en conditions normoxiques et hypoxiques, cette dernière permettant l’augmentation transcriptionnelle des ARNm codant la FlnA, et protéique de la FlnA et de l’UT. Nous avons à partir de la lignée de GBM U87, généré une lignée KnockOut (KO) délétée du gène codant la FlnA grâce au système CRISPR/Cas9. L’absence de FlnA dans la lignée U87, est associée à une réduction des capacités prolifératives, un mécanisme associé à une accumulation de cellules en phase G1 du cycle cellulaire, suggérant une faible progression des cellules vers la phase S et l’augmentation de la senescence. De plus, la délétion de la FlnA sensibilise les cellules U87 aux chimiothérapies TMZ et d’Irinotecan (CPT-11) testées à faibles concentrations (10-7M, chaque). En termes de motilité, les cellules U87 montrent spontanément la présence de lamellipodes, de fibres de stress d’actine et de points focaux d’adhésion, responsables d’une migration de type « mésenchymateuse endogène ». En revanche, les cellules FlnAKO présentent une diminution significative de leur motilité associée à la réduction du nombre d’adhésions focales marquées par un anti-Phospho_paxilline, ainsi qu’à une inhibition majeure de la polymérisation des fibres de stress d’actine. La quantification du nombre et du type de protrusions membranaires sur ces 2 lignées indique que les cellules U87-FlnAKO sont dans l’incapacité de générer et de stabiliser des lamellipodes. Ces observations montrent que la FlnA est essentielle pour la polymérisation des fibres de stress d’actine, formation de lamellipodes, et la maturation des points focaux d’adhésion indispensables à la migration chimiotactique directionnelle. Les travaux précédant de l’équipe avaient montré que le récepteur UT relaye la migration chimiotactique de gliome via l’activation de Gαi/PI3K/PIP3 et Gα12/13/Rho/ROCK permettant l’expansion du lamellipode et la maturation de points focaux d’adhésion comportant la vinculine. Dans la présente étude nous montrons que l’absence de FlnA prévient les cycles d’adhésion/dé-adhésion provoquées par la stimulation de l’UT par l’UII (10-8M), ainsi que la migration directionnelle en chambre de Boyden en réponse à des concentrations croissantes d’UII (10-12 M, 10-9 M et 10-7 M), suggérant que la FlnA contrôle la migration chimiotactique dépendante d’un RCPG tel que l’UT. Nous avons ensuite recherché si la FlnA était impliquée dans les couplages du récepteur UT et son trafic cellulaire. En présence de FlnA dans les cellules U87 exprimant le récepteur UTeYFP recombinant, les données immunocytochimiques montrent que le récepteur UT n’est pas associé à Gαq, mais est co-localisé voire précouplé à la protéine Gαi au lamellipode et que cette co-localisation est augmentée au niveau intracellulaire après un traitement par l’UII. Dans les cellules U87-FlnAKO, ce précouplage Gαi n’est pas retrouvé, alors que l’UT se trouve colocalisé avec Gαq principalement après traitement par l’UII. Cette acquisition de couplage est confirmée par la stimulation de la mobilisation calcique spécifiquement détectée dans les cellules U87-FlnAKO traitées par des concentrations croissantes d’UII. Ainsi, la FlnA semble essentielle au pré-couplage Gαi et l’exclusion du couplage Gαq dans les cellules de GBM. Lors d’une activation plus prolongée, le récepteur l’UT, présent dans des ruffles membranaires (ondulations de la membrane plasmique en préparation d’une expansion membranaire) des cellules U87 et être internalisé/endocyté après traitement par l’UII (10-7M, 10-9M). Ces ruffles membranaires sont absents dans les cellules U87-FlnAKO et l’UT est présent à la membrane plasmique y compris après un traitement prolongé en présence d’UII, suggérant que la FlnA joue un rôle central dans la régulation du transport au lamellipode et au processus d’internalisation du récepteur UT. Réciproquement, nous avons aussi montré que l’activation du récepteur UT entraîne dans les cellules U87 un clivage de la FlnA et une bande à 110-130 kDa détectée en Western blot, ainsi qu’une relocalisation du récepteur UT à la membrane plasmique. Ces mécanismes sont bloqués en présence de pertussis toxine (PTX) qui inhibe l’activité de Gαi, alors que les cellules émettent toujours de larges lamellipodes possiblement grâce au complexe  libéré et l’activation de PI3K. Les résultats obtenus lors des quantifications de la distribution du récepteur dans les différents compartiments cellulaires suggèrent donc que le clivage de la FlnA dépendant de la protéine Gi capable potentiellement d’inhiber l’activité d’une PKA et de stimuler de fait les calpaïnes, est nécessaire à l’accumulation du récepteur au lamellipode suite à une stimulation par l’UII. Enfin, nous avons réalisé des xénogreffes orthotopiques des lignées U87 et U87-FlnAKO dans des lignées de souris Nude/NMRI. Cette étude a permis de mettre en évidence une amélioration significative de la survie des animaux xénogreffés au niveau striatal avec la lignée U87-FlnAKO comparativement aux animaux contrôle. Des séries d’immunomarquages réalisés sur des cerveaux d’animaux prélevés de manière précoces (15 jours), ont permis de mettre un mettre en évidence une modification majeure du phénotype des GBM issus des cellules U87- FlnAKO. En effet, les GBM-U87 présentent un coeur tumoral plutôt d’apparence nécrotique et une morphologie hautement invasive, parfois multifocale, accompagnée d’un fort marquage de la FlnA et MMP-9 (Matrix Metallopeptidase 9), montrant une co-localisation des marquages UT et FlnA dans les processus invasifs et une angiogenèse anormale. A contrario, les GBMU87- FlnAKO présentent un phénotype hautement circonscrit accompagné d’une perte des marquages FlnA, UT et MMP-9, et d’une vascularisation plutôt normalisée. Cependant la persistance de la détection du marqueur CD44 dans ces tumeurs suggère que l’absence de FlnA n’impacte pas l’expression de tous les marqueurs mésenchymateux, mais réprime en aval les capacités invasives des cellules U87. L’ensemble de ces données montre que la FlnA joue un rôle majeur dans la régulation des phénomènes de prolifération et d’adhésion liés à la migration des cellules de GBM. De plus la FlnA contrôle directement la signalisation du récepteur UT en conditionnant d’une part son précoulage à la protéine Gαi et d’autre part en permettant l’internalisation/endocytose dynamique du récepteur après stimulation et son recyclage au lamellipode. Ainsi il est envisageable de développer des stratégies thérapeutiques ciblant spécifiquement l’interaction UT/FlnA afin de prévenir l’invasion du parenchyme sain relayée par l’activation de l’UT, mais de manière plus générale, par l’ensemble des systèmes chimiokines interagissant avec la FlnA.
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tel-02418263 , version 1 (18-12-2019)


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Alexandre Mutel. La Filamine A, acteur central relayant les mécanismes d'invasion des gliomes de haut-grade : implication dans la signalisation et le trafic du récepteur chimiotactique de l'urotensine II. Sciences du Vivant [q-bio]. Normandie Université, France, 2019. Français. ⟨NNT : ⟩. ⟨tel-02418263⟩
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