Study of the role and mechanism of action of two vasoactive peptides, urotensin II and urotensin II-related peptide on astrocyte function
Etude du rôle et du mécanisme d’action de deux peptides vasoactifs, l’urotensine II et l’urotensin II-related peptide sur la fonction astrocytaire
Résumé
Urotensin II (UII) and its paralog urotensin II-related peptide (URP) are two
cyclic neuropeptides considered as the most potent endogenic vasoactive factors
characterized so far. UII and URP interact with the UT receptor, classically coupled to
a phospholipase C. Peripheral effects of both UII and URP, especially in the
cardiovascular system, are well characterized. In contrast, the role in the central
nervous system remains unclear. UT is strongly expressed in motoneurons from the
spinal cord, but also in a subpopulation of astrocytes localized in some brain areas
such as hippocampus and thalamus. Several groups showed that UII exhibits mitogenic
effect on UT-transfected cells as well as on native cells which naturally express the
receptor. The UII and UT expression has been reported in different tumoral cell lines,
including ones derived from glioblastoma. In vivo, astrocyte proliferation is observed
during cerebral ontogenesis, neurodegenerative diseases and brain tumorigenesis.
Taken together, these data led us to examine the role of UII and URP in astroglial
activity in physiological and pathophysiological conditions. This project aimed at
i) characterizing UII and URP binding sites expressed by astrocytes and determining
the transduction pathways involved, ii) testing a potent peptidic antagonist of UT in
our model and iii) investigating a putative role of UII in pathologies associated with
astrocyte proliferation.
Several complementary methods allowed us to find the presence of mRNA
encoding UT (RT-PCR), and of its protein (western blot, flow cytometry) in cultured
rat cortical astrocytes. UII interacts with a very high- and high-affinity binding sites
coupled to a phospholipase C whereas URP binds a single receptor. Both peptides
stimulate the polyphosphoinositide (PIP) metabolism. Only very high-affinity binding
and UII-induced PIP metabolism increase are sensitive to pertussis toxin (PTX), a specific
Gi/Go protein blocker. Both UII and URP evoked a dose-dependent [Ca2+]c elevation
with an acute phase following by a plateau. However, sole the UII dose-response curve
is biphasic with a biological activity observed at very low concentrations (10-11 M).
Astrocyte response to UII and URP is abolished in the presence of U73122, a
phospholipase C inhibitor, and the specific blockade of IP3 receptor-channels by
2-APB strongly reduced both the peak and the plateau. Extracellular calcium chelation
by EGTA partially inhibited the first phase and suppressed the plateau. The use of
specific calcium channel blockers showed that the calcium influx mostly involves
T-type channels. These results indicate that both UII and URP, by activating UT
expressed by astrocytes, recruite calcium from intra- and extracellular pools via T-type
channels.
Researchers from the lab designed several UII and URP analogs, such as
[D-Trp4]URP, [Orn5]URP and [D-Tyr6]URP, which are able to block spasmogenic
effects of UII on rat aortic rings. Administered in the vinicity of astrocytes,
[D-Trp4]URP and [D-Tyr6]URP provoke a [Ca2+]c increase similar to that observed with
URP, whereas [Orn5]URP is devoid of any intrinsic activity. This compound induced a
dose-dependent inhibition of the calcium mobilization evoked by both UII and URP,
with rightward-shift of the dose-response curves accompanied by a decrease of
efficiency. These results are the first characterization of a potent urotensinergic
antagonist in a nervous native model, suggesting that [Orn5]URP is an interesting tool
for the development of new selective UT antagonists.
The last part of my Ph.D work concerns the study of the potential role of
urotensinergic system on astrocyte proliferation and astroglial tumor development. Our
results showed that only the application of graded concentrations of UII on astrocytes
increases cell density. In collaboration with Pr L’Houcine Ouafik (EMI-0359,
Marseille), we measured mRNA levels of UII, URP and UT in tumoral cell lines,
xenografts and human glioblastoma extracts. The four tumoral cell lines tested,
derived from astrocytoma (SW1088 and SW1783) and glioblastoma (U87 and U138),
express the genes encoding UII, URP and UT. A xenograft, resulting the U87 cell
injection in Nude mice, exhibits much greater levels of UII and UT mRNA than ones
measured from cultured cell lines. However, all human glioblastoma samples tested
expressed UII, URP and UT mRNA. Nevertheless, statistical analysis of our data
revealed that only the UII and the UT gene expression levels are positively correlated.
These results strongly suggest that the urotensinergic system may play an important
role in the control of glial tumorigenesis.
Taken together, these data indicate that, despite of their structural analogies, UII
and URP do not strictly share the same pharmacological profile and may exert distinct
physiological functions. In particular, UII might be involved in the control of cell
proliferation, especially during tumorigenesis of glial cells. This work opens some new
perspectives for astroglial tumor treatment.
L’urotensine II (UII) et son paralogue l’urotensin II-related peptide (URP) sont
deux neuropeptides cycliques considérés comme les facteurs endogènes vasoactifs les
plus puissants caractérisés à ce jour. L’UII et l’URP interagissent avec le récepteur
UT, classiquement couplé à une phospholipase C. Les effets périphériques, notamment
cardiovasculaires de l’UII et de l’URP sont bien caractérisés. En revanche, le rôle du
système urotensinergique au niveau cérébral reste très mal connu. L’UT est fortement
exprimé dans les motoneurones de la moelle épinière mais également dans une souspopulation
astrocytaire de certaines aires cérébrales comme l’hippocampe et le
thalamus. Plusieurs groupes ont mis en évidence des effets mitogènes de l’UII sur des
cellules transfectées par l’ADNc codant l’UT, ou des cellules normales natives
connues pour exprimer le récepteur. De plus, l’expression de l’UII et de l’UT a été
mise en évidence dans différentes lignées tumorales dont certaines sont issues de
glioblastomes. La prolifération des astrocytes peut être observée in vivo au cours de
l’ontogenèse cérébrale, de maladies neurodégénératives ou du développement de
tumeurs cérébrales. L’ensemble de ces données nous a conduit à étudier le rôle de
l’UII et de l’URP dans le contrôle de l’activité astrocytaire en conditions
physiologiques et physiopathologiques. Le projet de recherche a consisté à
i) caractériser les sites de liaison de l’UII et l’URP sur les astrocytes et déterminer les
voies de transduction associées à leur activation, ii) valider un éventuel antagoniste
peptidique de l’UT dans notre modèle et iii) rechercher un rôle potentiel de l’UII
in vivo dans certaines pathologies associées à une prolifération astrocytaire.
Plusieurs approches complémentaires ont permis de mettre en évidence la
présence des ARNm codant l’UT (RT-PCR), et de la protéine (western blot,
cytométrie en flux) dans les astrocytes corticaux de Rat en culture. L’UII interagit avec
des sites de très haute et haute affinités tandis que l’URP fixe un unique récepteur. Les
deux peptides sont capables de stimuler le métabolisme des PIPs Seules la liaison (site
de très haute affinité) et l’activité stimulante de l’UII sur le métabolisme des PIP sont
sensibles à la toxine pertussique (PTX), un bloqueur des protéines Gi/Go. L’UII et
l’URP entraînent une élévation dose-dépendante de la [Ca2+]c dont le profil se
caractérise par une phase aiguë suivie d’une phase plateau. Cependant, seule la courbe
dose-réponse de l’UII est biphasique avec une activité biologique observée dès 10-11
M. La réponse des astrocytes à l’UII et l’URP est supprimée en présence d’U73122, un
inhibiteur de phospholipase C, et le blocage des récepteurs-canaux de l’IP3 par le 2-
APB réduit considérablement les deux phases calciques. La chélation du calcium
extracellulaire par l’EGTA inhibe partiellement la première phase et supprime la phase
plateau. L’utilisation de bloqueurs sélectifs de canaux calciques montre que l’influx de
calcium met majoritairement en jeu des canaux de type T. Ces résultats montrent que
l’UII et l’URP, en activant l’UT exprimé par les astrocytes, mobilisent le calcium à
partir des pools intra- et extracellulaires principalement via le recrutement des canaux
calciques de type T.
Les chercheurs du laboratoire ont synthétisé plusieurs dizaines d’analogues de
l’UII et de l’URP, dont le [D-Trp4]URP, l’[Orn5]URP et le [D-Tyr6]URP, qui sont
capables de bloquer les effets spasmogènes de l’UII sur des anneaux d’aortes de Rat.
Appliqués au voisinage d’astrocytes, le [D-Trp4]URP et le [D-Tyr6]URP entraînent une
élévation de la [Ca2+]c semblable à celle observée avec l’URP, tandis que l’[Orn5]URP
est dépourvu d’activité intrinsèque. Ce composé inhibe de façon dose-dépendante la
mobilisation calcique induite par l’UII et l’URP et provoque un décalage vers la droite
des courbes doses-réponses associé à une diminution de leur efficacité. Ces résultats
constituent la première caractérisation d’un puissant antagoniste urotensinergique sur
un modèle de cellules nerveuses natives et font de l’[Orn5]URP un outil
particulièrement intéressant pour le développement de nouveaux antagonistes sélectifs
de l’UT.
La dernière partie de mes travaux de thèse porte sur l’étude du rôle potentiel du
système urotensinergique sur le contrôle de la prolifération cellulaire et le
développement de tumeurs d’origine astrocytaire. Nos résultats montrent que seule
l’application de concentrations croissantes d’UII sur des astrocytes entraîne une
élévation de la densité cellulaire. En collaboration avec le Pr L’Houcine Ouafik (EMI-
0359, Marseille), nous avons mesuré les taux d’ARNm codant l’UII, l’URP et l’UT
dans des extraits de lignées tumorales, de xénogreffes et de glioblastomes humains.
Les quatre lignées tumorales testées, issues d’astrocytomes (SW1088 et SW1783) et
de glioblastomes (U87 et U138), expriment les gènes codant l’UII, l’URP et l’UT. Les
xénogreffes, obtenues par injection de cellules U87 chez des souris immunodéprimées,
présentent des taux d’UII et d’UT nettement supérieurs à ceux observés dans la lignée.
Par ailleurs, tous les échantillons de glioblastomes humains testés expriment les
ARNm codant l’UII, l’URP et l’UT. Cependant, l’analyse statistique des données a
révélé que seuls les taux d’ARNm de l’UII sont corrélés à ceux de l’UT. Ces résultats
suggèrent que le système urotensinergique pourrait jouer un rôle important dans le
contrôle de la tumorigenèse cérébrale.
L’ensemble de ces données indique qu’en dépit de leurs analogies structurales,
l’UII et l’URP n’ont pas strictement le même profil pharmacologique et pourraient
donc exercer des rôles physiologiques distincts. En particulier, l’UII pourrait être
impliquée dans le contrôle de la prolifération de ces cellules, notamment dans le cas de
tumeurs cérébrales d’origine gliale. Ces travaux ouvrent ainsi de nouvelles
perspectives de recherche dans le traitement des tumeurs cérébrales d’origine
astrocytaire.
Origine : Fichiers produits par l'(les) auteur(s)
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