Study of signaling pathways associated with the effects of the vasoactive peptide urotensin II on the migration and adhesion of glial tumor cells
Etude des voies de signalisation associées aux effets du peptide vasoactif urotensine II sur la migration et l'adhésion des cellules tumorales gliales
Résumé
Chemotaxis is a guiding mechanism including a first processing phase through diffusion
of a gradient concentration of specific mediators, and a second detection phase of this
chemical gradient (defined as a chemoattractant or chemorepellant signal), by cell or
organisms, and the adaptation of the movement direction. Although chemotaxis and
directional migration finally represent universal mechanisms, and that detailed involved
processes are widely studied, they constitute a major challenge for research exhibiting a
number of physiopathological applications from embryogenesis, tissue repair and
regeneration, inflammation to cancer.
The development of cerebral glial tumors required specific features as tumoral cell
invasion, neoangiogenesis and chemoattraction of proangiogenic macrophage cells. Despite
intense research in neuro-oncology, the survival median of patients with high-grade tumors
such as glioblastoma is only 15 months. Thus, G protein-coupled receptors (GPCRs) and their
ligands expressed in glioblastoma and relaying effects on migration, invasion and
angiogenesis, represent potential therapeutic targets. GPCRs are indeed able to recruit
heterotrimeric G proteins and tyrosine kinase receptors (RTKs) likely through the formation
of macromolecular complexes involving GPCR C-terminal cytosolic domains. Among major
chemotaxis players, GPCR ligands, i.e. chemokines, lipids and vasoactive peptides, stimulate
migration/invasion of various cell types, including tumor cells.
Urotensin II (UII) and its paralog urotensin II-related peptide (URP) are the endogenous
ligands of a GPCR named UT and are considered as most potent vasoactive factors
characterized to date. The work performed in the team had previously shown the expression
of UT in rat cortical astrocytes, in human astrocytes and in a high grade glioma cell line, and a
specific role of UII in astrocyte proliferation/survival. These data suggested that the
urotensinergic system would play a major role in astrocyte activity in physiological and
pathophysiological conditions, and contribute to the development of high grade glioma.
In this context, the aim of my thesis work was to determine the role of the urotensinergic
system in the development of brain tumors of glial origin through in vitro investigation of
signaling events relayed by UT. This research project aimed to i) investigate urotensinergic
system expression in glioma, determine the effects of UII on proliferation, migration and
adhesion of glial tumor cells and characterize the signaling pathways involved in these effects
using pharmacological and molecular tools, ii) identify, by using two-hybrid strategy, protein
partners of the C-terminal cytosolic domain of UT, potentially involved in transduction
pathways activated by UII and iii) identify by means of a phosphoproteomics approach, a set
of proteins phosphorylated and dephosphorylated in a glioblastoma cell line exposed to the
UII peptide.
In the first part of my work, we showed the expression of UT and UII in human
astrocytoma and glioblastoma cell lines, in tumor explants from patients as well as in
glioblastoma tissue sections obtained in collaboration with the anatomocytopathology
department of the Rouen University Hospital. In fresh glioblastoma tumor explants and
glioma cell lines, we demonstrated that UT was not coupled to the classical IP3/Ca2+pathway
ang failed to modify proliferation, cell cycle progression as wel as ERK1/2 and AKT
pathways. We have established for the first time that a gradient of low UII concentration
induced chemotaxic migration of glioma cells. This effect was concentration-dependent and
blocked by peptidic (urantide) and non-peptidic (palosuran) UT antagonists. Pharmacological
agents, i.e. Gi/o (PTX), PI3K (LY294002), and ROCK (Y27632) inhibitors, and molecular
tools (UT mutated in the G protein interacting motif ERY or siRNA anti Gα13), highlighted
that UII-mediating migration is mainly relayed by the G13/Rho/ROCK cascade but also
involved the Gi/o/PI3K pathway. Conversely, a high homogeneous concentration of UII
inhibited cell motility and stimulated cell-matrix adhesions likely through actin
polymerization, formation and maturation of focal adhesions. Glioma cell-matrix adhesion
was shown to be mainly mediated by Gi/o and partially involved PI3K. In conclusion, these
results suggest that UT behaves like a professional chemotaxic receptor activating a signaling
switch between the directional cell migration and adhesion in response to a gradient or a
uniform concentration of UII respectively and thus should play a role during high-grade
glioma development.
In the second part of this work, by means of the two-hybrid system, we aimed to
characterize protein partners of the UT C-terminal domain. Thus, we identified 8 proteins
including filamin A, an actin binding protein classically known to be involved in cell
adhesion and migration. We showed that this large and multidomain protein interacted with
the 332-351 C-terminal fragment of the human UT, through its 16 to 19 domains. We
obtained some encouraging data confirming the interaction between UT and filamin A by
GST-pull down, but our co-immunoprecipitation and bioluminescence resonance energy
transfer (BRET) experiments have to be reproduced with modifications in the strategy. By
using cell lines deficient for filamin A (M2) or stably expressing filamin A (A7), we
determined that this multifunctional protein is important for the dimerization of UT and the
subcellular localization of the receptor. By immunocytochemistry, we observed that UT is
colocalized with filamin A at the lamellipodia in A7 cells, or is mainly localized at the plasma
membrane in M2 cells. After exposure to the agonist, UT appeared translocated to the plasma
membrane in A7 whereas internalized (punctiform cytoplasmic labeling) in M2 cells. In both
cell types (M2 and A7), UII stimulated cell migration and actin polymerization with a more
pronounced effect on cells lacking filamin A. By flow cytometry and immunocytochemistry,
we finally detected high filamin A expression in glioma cell lines U87 and SW1088 and in
glioblastoma explants from patients. In these tumor cells, filamin A was colocalized with UT
in protrusions and in cells exhibiting a fusiform morphology, and UII led to the
dephosphorylation (Ser 2151) and cleavage of filamin A. Taken together, these results suggest
that filamin A favors the formation of oligomeric structures, the cytosolic localization of UT,
the translocation of UT at the plasma membrane and plays a role in cell migration. One
hypothesis is that translocation of UT oligomers to the plasma membrane maybe subsequent
to the activation of a subpopulation of mobile membrane UT, relays within lipid rafts,
signaling pathways of cell adhesion.
To identify the cellular actors of migration and adhesion, effectors of the urotensinergic
system, we conducted a phosphoproteomics analysis of glioma cell line U87 in the absence or
the presence of UII. This study, conducted in collaboration with the Proteomic platform
PISSARO (Philipe Chan, Pascal Cosette, Julie Hardouin, Antoine Obry) allowed us to
identify 13 and 32 proteins whose levels of phosphorylation and dephosphorylation were
increased. Among them, 13 including filamin A, filamin C, LIMK or talin are involved in cell
migration and/or adhesion. Validation by Western blot and the more detailed study of the
identified proteins, will allow us to better understand the complexity of UT signaling
pathways relaying mechanisms of migration and adhesion.
Thus, we aim to initiate the development of urotensinergic ligands that would only activate
adhesion pathways of glial tumor cells. Such ligands, promoting cell-matrix and cell-cell
adhesions would confine the tumor mass by inhibiting invasion, neoangiogenesis, and
chemoattraction of proangiogenic macrophages.
Le chimiotactisme est un mécanisme de guidage comprenant une première étape de
génération par diffusion d'un gradient de concentration d'un médiateur spécifique, une
deuxième étape de détection de ce gradient chimique (étant défini comme chimio-attractant
ou chimio-repoussant) par les cellules ou organismes, et une troisième étape de modification
de la direction du déplacement. Bien que le chimiotactisme et la migration directionnelle
représentent un mécanisme universel et que les processus impliqués soient très étudiés, ils
constituent un enjeu majeur de recherche dont les applications s’étendent à l’embryogenèse, la
réparation et la régénération tissulaire, la réponse inflammatoire mais aussi au cancer.
Le développement des tumeurs cérébrales d’origine gliale s’accompagne de mécanismes
invasifs, néoangiogéniques, et de chimioattraction de cellules macrophagiques proangiogéniques.
En dépit des progrès réalisés en neurooncologie, les patients atteints de
tumeurs de haut grade telles que les glioblastomes, présentent une médiane de survie de
seulement 15 mois. Ainsi, les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) et leurs ligands
exprimés dans les glioblastomes et relayant des effets sur la migration, l’invasion et la
néoangiogenèse représentent des cibles thérapeutiques potentielles. Les RCPGs sont en effet
capables de recruter certaines protéines G hétérotrimériques, ainsi que des récepteurs tyrosine
kinase (RTKs) via notamment la formation de complexes macromoléculaires au niveau de
leurs domaines C-terminal cytosoliques. Parmi les principaux acteurs du chimiotactisme, les
ligands de RCPGs, i.e. chimiokines, lipides et peptides vasoactifs, stimulent la
migration/invasion de divers types cellulaires et notamment des cellules cancéreuses.
L’urotensine II (UII) et son paralogue l’urotensin II-related peptide (URP) sont les ligands
endogènes d’un RCPG nommé UT et sont considérés comme les facteurs vasoactifs les plus
puissants caractérisés à ce jour. Les travaux réalisés dans l’équipe ont précédemment mis en
évidence l’expression de l’UT dans les astrocytes corticaux de Rat en culture, dans des
astrocytes humains et dans une lignée de gliome de haut grade, ainsi que le rôle spécifique de
l’UII sur la prolifération/survie des astrocytes. Ces données suggèrent que le système
urotensinergique joue un rôle majeur dans l’activité des astrocytes en conditions
physiologique et physiopathologique, et contribuerait au développement des gliomes de haut
grade.
Dans ce contexte, l’objectif de mon travail de thèse visait donc à déterminer le rôle du
système urotensinergique dans le développement des tumeurs cérébrales d’origine gliale, par
une analyse des mécanismes de signalisation relayés par l’UT in vitro. Ce projet de recherche
a consisté à i) rechercher l’expression du système urotensinergique dans les gliomes,
déterminer les effets de l’UII sur la prolifération, la migration et l’adhésion des cellules
tumorales gliales et caractériser les voies de signalisation impliquées dans ces effets à l’aide
d’outils pharmacologiques et moléculaires, ii) identifier par double-hybride des partenaires
protéiques du domaine C-terminal cytosolique de l’UT, potentiellement impliqués dans les
voies de signalisation activées par l’UII et iii) rechercher, par une approche
phosphoprotéomique, un ensemble de protéines phosphorylées et déphosphorylées dans une
lignée de glioblastome exposée au peptide UII.
Dans la première partie de mes travaux, nous avons montré l’expression de l’UT et de
l’UII dans des lignées humaines d’astrocytomes et de glioblastomes, dans des explants
tumoraux issus de patient ainsi que dans des sections de glioblastome obtenues en
collaboration avec le service d’anatomopathologie du CHU de Rouen. Sur les lignées
tumorales gliales et des explants tumoraux, nous avons démontré que l’UT n’est pas couplé à
la voie classique IP3/Ca2+, ne modifie pas la prolifération, la progression du cycle cellulaire, et
n’active pas les voies ERK1/2 et AKT. Nous avons établi pour la première fois qu’un gradient
d’UII induit la migration cellulaire chimiotactique des gliomes. Cet effet est concentrationdépendant
et est bloqué par les antagonistes peptidique (urantide) et non peptidique
(palosuran) de l’UII. Des outils pharmacologiques, i.e. des inhibiteurs de Gi/o (PTX), de PI3K
(LY294002) et de ROCK (Y27632), et moléculaires (UT muté sur le domaine ERY
d’interaction aux protéines G et siRNA anti Gα13), nous ont permis de déterminer que les
effets de l’UII sur la migration sont principalement relayés par la voie G13/Rho/ROCK et que
la voie Gi/o/PI3K est également impliquée. A l’inverse, une forte concentration homogène
d’UII inhibe la motilité cellulaire et stimule les adhésions cellule-matrice et provoque la
polymérisation d’actine, la formation et la maturation d’adhésions focales. Le processus
d’adhésion cellule-matrice est dépendant de l’interaction de l’UT à la protéine Gi/o et implique
en partie la PI3K. En conclusion, ces résultats suggèrent que l’UT se comporte comme un
récepteur chimiotactique professionnel relayant les changements de signalisation entre la
migration directionnelle et l’adhésion cellulaire en réponse à un gradient ou à une
concentration homogène d’UII respectivement, et pourrait participer au développement des
gliomes de haut grade.
Dans la deuxième partie de mes travaux de thèse, nous avons recherché par double-hybride
les partenaires protéiques du domaine C-terminal de l’UT et identifié 8 protéines dont la
filamine A, une protéine de liaison à l’actine impliquée dans les processus de migration et
d’adhésion cellulaires. Nous avons déterminé que cette protéine via ses domaines 16 à 19
interagit avec le fragment 332-351 de l’UT humain. Bien qu’encourageantes, les tentatives de
confirmation de l’interaction entre l’UT et la filamine A par GST-pull down ou
bioluminescence resonance energy transfer (BRET) seront encore à mettre au point. Grâce
aux lignées déficientes en filamine A (M2) et exprimant stablement la filamine A (A7), nous
avons déterminé que cette protéine présentant de multiples domaines d’intérêt, est importante
pour la dimérisation de l’UT et la localisation subcellulaire du récepteur. Des études
d’immunocytochimie ont révélé que l’UT est colocalisé avec la filamine A au niveau des
lamellipodes dans les cellules A7, ou bien se trouve principalement localisé à la membrane
plasmique dans les cellules M2. Après exposition à l’agoniste, l’UT semble transporté à la
membrane plasmique des cellules A7, tandis qu’il est internalisé (marquage ponctiforme
cytoplasmique) dans les cellules M2. Sur les deux types cellulaires (M2 et A7), l’UII stimule
la migration cellulaire et la polymérisation d’actine avec un effet plus prononcé sur les
cellules déficientes en filamine A. Par cytométrie en flux et immunocytochimie, nous avons
montré que la filamine A est hautement exprimée dans les lignées de gliomes SW1088 et U87
et dans des explants de glioblastome issus de patients et qu’elle est colocalisée avec l’UT dans
des protrusions et dans des cellules de morphologie fusiforme. Dans une lignée de gliome,
l’UII entraîne la déphosphorylation de la filamine A (Ser 2151) et son clivage. L’ensemble de
ces résultats suggère que la filamine A favorise la formation de dimères, la localisation
principalement cytosolique de l’UT, est clivée après traitement UII, et participe à la migration
cellulaire. Une des hypothèses est que la translocation de dimères d’UT à la membrane
plasmique, consécutive à l’activation d’une population de récepteurs membranaires mobiles,
relayerait, au sein de radeaux lipidiques, les voies de signalisation de l’adhésion cellulaire.
Afin d’identifier les acteurs cellulaires de la migration et de l’adhésion effecteurs du
système urotensinergique, nous avons réalisé l’analyse phosphoprotéomique de cellules de
lignée de gliome U87 en présence ou en absence d’UII. Cette étude, réalisée en collaboration
avec la plate-forme de protéomique PISSARO (Philipe Chan, Pascal Cosette, Julie Hardouin,
Antoine Obry) nous a permis d’identifier 13 et 32 protéines dont les niveaux de
phosphorylation et de déphosphorylation sont augmentés, parmi lesquelles 13 sont impliquées
dans la migration et/ou l’adhésion cellulaire dont la filamine A et C, la LIMK et la taline. La
validation par Western blot et l’étude plus précise des protéines identifiées nous permettra de
mieux comprendre la complexité des voies de signalisation de l’UT relayant les mécanismes
de migration et d’adhésion.
Ainsi, nous envisageons le développement de ligands urotensinergiques qui activeraient
uniquement la voie d’adhésion des cellules tumorales gliales. De tels ligands, en favorisant les
adhésions cellule-matrice et cellule-cellule confineraient la masse tumorale en inhibant
l’invasion, la néoangiogenèse, et la chimioattraction de macrophages pro-angiogéniques.
Origine : Fichiers produits par l'(les) auteur(s)
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