Study of the activation mechanisms of chemotactic receptors coupled to G proteins: Signaling bias and role of a proline in the second transmembrane domain
Etude des mécanismes d'activation des récepteurs chimiotactiques couplés aux protéines G : Biais de signalisation et rôle d'une proline dans le deuxième domaine transmembranaire
Résumé
G protein-coupled receptors (GPCRs) display a form of conservation in term of
structure and signaling mode but also show diversification, allowing specialization. An
important specialization during evolution is undoubtedly the pro-chemoattractant capability
that enables the development of organs and vascularization, or immune responses. These
chemotactic behaviors may involve G protein couplings but also interaction with intracellular
proteins including β-arrestins. However, still reside the questions on i) their ability to detect
low concentrations / molecular gradients, ii) transducing the extracellular binding domain
signal to the intracellular domain of the receptor, and iii) the modes of interaction of β-
arrestins to the cytosolic GPCR domains. Recent data provided by the high-resolution
structures indicate that GPCRs are dynamic entities that adopt multiple conformations, i.e.
active able to link different types of ligands to activate in a biased manner receptor coupling
pathways, leading to functional selectivity.
Based on previous works of the team, we hypothesized that urotensin II (UII)-derived
peptides displayed unexpected physiological effects because of such biased signaling on the
GPCR UT receptor. We determined the coupling to G proteins and β-arrestins of the UIIactivated
UT receptor expressed in HEK293 using bioluminescence resonance energy transfer
(BRET) biosensors, as well as the production of IP1-3 and cAMP using homogenous timeresolved
Forster resonance energy transfer (FRET) (HTRF)-based assays. We showed that
activated UT coupled to Gi1, GoA, Gq, and G13, excluding Gs, and recruited β-arrestins 1 and 2.
Integration of these pathways led to a 2-phase kinetic phosphorylation of ERK1/2 kinases.
The tested peptides induced three different profiles: UII, urotensin-related peptide (URP), and
UII4–11 displayed the full profile; [Orn8]UII and [Orn5]URP activated G proteins, although
with pEC50s 5–10× higher, and did not or barely recruited β-arrestin; urantide also failed to
recruit β-arrestin but displayed a reversed rank order of pEC50s for Gi and Gq vs. Go and was a
partial agonist of all G-protein pathways. Interestingly, the peptides differently modulated cell
survival but similarly induced cell migration and adhesion. Thus, we demonstrate biased
signaling between β-arrestin and G proteins, and between G-protein subtypes, which dictates
the receptor's cellular responses and may open therapeutic new opportunities.
We thus addressed whether the chemotactic properties of UT, quite unexpected since the
urotensinergic system was previously characterized as a potent vasoactive system, may evolve
from a structural signature acquired early during evolution. Based on previous published data,
it is proposed that an evolutionary ancestral deletion in TM2, leading to a repositioning of a
Abstract
proline in 2.58, of some Rhodopsine-like GPCRs belonging to the PEP (peptide) receptor
family, allowed expansion of the SO (somatostatinergic), CHEM (chemokine) and PUR
(purinergic) receptors phylogenetically linked. Thus, by studying the PEP receptor prototype
Kiss1R, exhibiting a proline in 2.59, and the UT and CXCR4 receptors, as respective
prototypes of SO and CHEM receptor groups, we aimed to gain information on the role of
this P2.58 in the acquisition of chemotactic behaviour. Thus, we have proceeded by
engineering the P2.59 prototype Kiss1R and the two P2.58 UT and CXCR4 receptors by
single mutation of Pro to Ala or insertion/deletion to reposition the Pro.
We showed that wild-type and mutant Kiss1R, UT and CXCR4 expressed in HEK293 cells
conserved expression levels and for most, binding capacities. The P2.58 UT and CXCR4
receptors activated by UII and SDF-1α, exhibited Gq/Ca2+/IP1 (UT) and/or Gi/o and β-Arrestin
2 couplings, as well ERK1/2 activation. They stimulated chemotactic migration via dynamic
wave of assembly/disassembly of focal adhesions (FAs) associated with the selection of one
prominent lamellipodia. In contrast, activation of the P2.59 Kiss1R receptor by Kisspeptin
(KP-10) evoked Gq/Ca2+/IP1 couplings, and random migration through uncontrolled
disassembly of FAs and production of many lamellipodia per cells. Single mutation or
insertion/deletion mainly led to loss of Gq and/or Gi1 and Goa coupling capacities, establishing
the key role of the proline in TM2 of Kiss1R, UT and CXCR4 in receptor activation. In
addition, the P2.59 to P2.58 repositioning likely played a role in receptor re-sensitization,
determinant for regulation of FAs assembly/disassembly and reduction of the number of
lamellipodia.
Thus, we propose that P2.58 receptors expanding during evolution, acquired a key
competence to favor cell chemotactic migration under external ligand signals. This would be
associated with a dynamic of receptor desensitization/resensitization and localized adhesionde-
adhesion waves, selecting protrusions necessary for cell directed migration. This specific
competence of P2.58 in general and the UT receptor in particular, likely involves a key
functional selectivity towards β-arrestins.
Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) affichent à la fois une structure et des
voies de signalisation conservées mais aussi une grande diversité fonctionnelle, nécessaire à
la spécialisation. Une spécialisation importante au cours de l'évolution est sans nul doute
l’apparition du caractère chimiotactique, qui permet le développement des organes et la
vascularisation, ou encore les réponses immunitaires. Ces comportements chimiotactiques
induits par les RCPGs peuvent impliquer des couplages de protéines G mais également une
interaction avec des protéines intracellulaires telles que les β-Arrestines. Cependant, les
questions portant sur les RCPGs dans i) leur capacité à détecter de faibles
concentrations/gradients moléculaires, ii) la transduction du signal depuis la poche de liaison
jusqu’au domaine intracellulaire du récepteur, et iii) les modes d'interaction des β-arrestines
restent aujourd’hui l’objet de nombreuses recherches. Les données récentes fournies par les
structures à haute résolution indiquent que les RCPG sont des entités dynamiques qui
adoptent des conformations actives multiples, capables de lier des ligands et d’activer
préférentiellement ou non certaines voies de couplage de manière dite « biaisée », conduisant
ainsi à la sélectivité fonctionnelle.
Sur la base de travaux antérieurs menés par l'équipe, nous avons émis l'hypothèse que les
peptides dérivés de l'urotensine II (UII) présentent des effets physiologiques inattendus en
raison d'une signalisation biaisée sur le RCPG urotensinergique UT. Dans un modèle de
cellules HEK293 exprimant le récepteur UT humain recombinant, nous avons déterminé le
couplage aux protéines G et aux β-arrestines suite à l’activation du récepteur par l’UII, en
utilisant la méthode de transfert d’énergie de bioluminescence par résonance (BRET), ainsi
que la production d'IP1et d'AMPc en utilisant le principe de HTR-FRET (high-time resolved-
Froster resonance energy transfer). Nous avons montré que le récepteur UT active les
protéines Gi1, GoA, Gq et G13 (et non Gs) et recrute les β-arrestines 1 et 2. Ces premiers
évènements conduisent à 2 phases de phosphorylation des kinases ERK1/2. Les peptides
testés induisent trois profils différents: l'UII, l’urotensin II-related peptide (URP) et l'UII4-11
présentent le profil d’agoniste entier; l’[Orn8]UII et l’[Orn5]URP activent les protéines G avec
cependant des pEC50s 5 à 10 fois plus élevés, et ne recrutent pas ou peu les β-arrestines;
l’urantide ne présente pas non plus la capacité d’induire le recrutement des β-arrestines mais a
montré une efficacité inversement proportionnelle à activer les protéines Gi et Gq vs. Go et se
présente donc comme un agoniste partiel de toutes les voies des protéines G. Il est intéressant
de noter que les peptides sont tous capables d’induire la migration et l’adhésion cellulaire,
Résumé
mais régulent différemment la survie cellulaire. Ainsi, nous démontrons une signalisation
biaisée entre les protéines β-arrestine et G, et entre les sous-types de protéines G, ce qui dicte
les réponses cellulaires du récepteur et peut ouvrir de nouvelles opportunités thérapeutiques.
Nous avons ensuite examiné si les propriétés chimiotactiques de l'UT, tout à fait
inattendues puisque l’UII était principalement connu pour ses propriétés vasoactives, sont
associées à une signature structurale acquise précocement au cours de l'évolution. De fait, il
avait été proposé qu'au sein des récepteurs de la famille Rhodopsine, une délétion ancestrale
évolutive dans le DTM2 de récepteurs du groupe ancestral PEP (peptides), conduisant au
repositionnement d'une proline en 2.58, aurait accompagné l'expansion des récepteurs des
groupes SO (somatostatinergique), CHEM (chimiokine) et PUR (purinergique),
phylogénétiquement liés. Ainsi, en étudiant le prototype de récepteur PEP Kiss1R, présentant
une proline en 2.59, et les récepteurs UT et CXCR4, en tant que prototypes respectifs des
récepteurs SO et CHEM, nous avons cherché à obtenir des informations sur le rôle de cette
proline P2.58 dans l'acquisition du comportement chimiotactique. Pour cela, nous avons
généré des mutants des prototypes Kiss1R P2.59 et des deux récepteurs P2.58 UT et CXCR4
par substitution de la Pro du DTM2 en Ala, ou par insertion/délétion pour déplacer la proline
en position 2.58 ou 2.59.
Nous avons montré, dans un modèle de cellules HEK293 recombinantes, que les récepteurs
Kiss1R, UT et CXCR4 mutants conservent une expression membranaire et pour la plupart,
des capacités de liaison. Les récepteurs P2.58 UT et CXCR4 activés par l’UII et le SDF-1α,
montrent des couplages Gq/Ca2+/IP1 et/ou Gi/o et β-Arrestine 2, et sont capables de stimuler la
migration chimiotactique par ondes dynamiques d'assemblage/désassemblage de points
focaux d’adhésion (FA), ainsi que via la sélection d’un lamellipode principal. En revanche,
l'activation du récepteur Kiss1R (P2.59) par la kisspeptine-10 (KP-10) évoque des couplages
Gq/Ca2+/IP1 et une migration aléatoire par désassemblage incontrôlé des FA, et la production
de nombreux lamellipodes par cellule. La mutation de la proline ou l’insertion/délétion
conduit principalement à la perte des capacités de couplage Gq et/ou Gi1 et GoA, établissant le
rôle clé de cette proline du DTM2 dans les mécanismes d’activation de Kiss1R, UT et
CXCR4. Ainsi, le repositionnement de la proline de la position 2.59 à 2.58 joue probablement
un rôle dans la re-sensibilisation des récepteurs, déterminante pour la régulation de
l'assemblage/désassemblage des FAs et la réduction du nombre de lamellipodes.
L’ensemble de ces données nous amène à proposer que l’expansion massive des récepteurs
P2.58 au cours de l’évolution est corrélée à l’acquisition de mécanismes d’activation prochimiotactiques
par la régulation spatio-temporelle de signaux intracellulaires. Notamment, ce
Résumé
mécanisme d’activation spécifique serait associé à une dynamique de désensibilisation/resensibilisation
des RCPG, à des vagues d’adhésion/détachement locales et à la sélection des
protrusions membranaires nécessaires à une migration chimiotactique efficace. Cette
compétence spécifique aux récepteurs P2.58, et en particulier de l’UT, implique probablement
une sélectivité fonctionnelle clef vis-à-vis des β-Arrestines.
Origine : Fichiers produits par l'(les) auteur(s)
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