Mise en évidence d’une interaction fonctionnelle entre le récepteur GABAA et le récepteur du peptide vasoactif urotensine II : implication potentielle dans la fonction astrocytaire. - Normandie Université Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2010

Demonstration of a functional interaction between the GABAA receptor and the vasoactive urotensin II receptor: potential involvement in astrocytic function

Mise en évidence d’une interaction fonctionnelle entre le récepteur GABAA et le récepteur du peptide vasoactif urotensine II : implication potentielle dans la fonction astrocytaire.

Résumé

Considered as passive cells in the central nervous system, astrocytes play a pivotal role in the neurovascular unit controlling metabolic support to neurons, synaptic function and/or neurogenesis and synaptogenesis, via the expression of a plethora of receptors/ion channels/transporters and the release of autocrine/paracrine factors. Reactive astrogliosis observed during cerebral lesions such as ischemia, could be controlled by vasoactive factors locally over-expressed. Urotensin II (UII) and its paralog, the urotensin II-related peptide (URP), are two neuropeptides currently considered as the most potent vasoactive factors characterized. Previous studies conducted in our team have showed that Rat cortical astrocytes expressed functional UT receptors, and that UII activates Gq/PLC/Ca2+ and Gi/o transduction pathways, T-type calcium channels, and stimulates cell proliferation. The distinct UT affinities for UII and URP, and the UT-associated different couplings to G-proteins would be explained by receptor plasticity regulating by astrocyte proliferation, involving cross-talk of UT with other receptors. Receptor plasticity has ever been suggested for the GABAA receptor, whose functional expression at the plasma membrane is inversely proportional to the degree of astrocyte proliferation, after a stroke or in malignant astrocytes. These data suggest that the GABAA receptor works as a repressor of cell proliferation. A study demonstrating that the UII modulates the GABAergic function in Aplysia neurons suggested a possible interaction between the mitogenic effects of UII and the repressor activity of the GABAA receptor on astrocyte proliferation in physiopathological conditions. Thus, this project aimed at i) demonstrating that UT and the GABAA receptor are coexpressed in astrocytes and investigating the existence of a bidirectional functional interaction between the two receptors, ii) characterizing the mechanism of the UII-induced inhibition of the GABAergic function in astrocytes from cerebellum co-cultured with neurons, and in a cell line coexpressing the human UT and GABAA receptor subunits, and iii) identifying theIn cultured cortical astrocytes, we showed for the first time that UII binding induces a dose-dependant stimulation of cAMP production. This effect is suppressed by the specific AC antagonist SQ22536, and sustained in the presence of the PKA inhibitor H89, suggesting the existence of a negative feed-back of the AC/cAMP/PKA system on UT functioning. Moreover, UII induces a concentration-dependant stimulation of the PIPs turnover, reduced in the presence of H89. These data suggest that UII stimulates cAMP formation and activates PKA, that would provoke a switch of UT coupling from Gs to Gi on the one hand, and Gq, on the other hand. We demonstrated that activation of the GABAA receptor counteracts the effects of UII on both PIPs turnover and cAMP production, thus providing the evidence that UT function can be regulated by the GABAA receptor in astrocytes. Double labeling studies performed on slices from Rat cerebellum revealed that UT and the γ1 and γ2 subunits of the GABAA receptor mainly co-localize in glial processes in the molecular layer and in Purkinje cells. On astrocyte/neuron co-cultures from cerebellum, UT and the γ1 subunit are predominantly expressed in Purkinje cells and astrocytes. In this coculture model, we showed that UII reduces the membrane depolarization and induces a dose dependant inhibition of the chloride current evoked by the GABAA receptor agonist, isoguvacine. On a CHO cell line that stably express the human UT (CHO-UT) and transiently transfected with different combinations of cDNA encoding GABAA receptor subunits, UII i) significantly inhibits the chloride current from the concentration of 10-13 M (β3γ2 ≈ α2β3γ2 ≈α2β1γ2 > α2β3γ1 > α2β1γ1), ii) is more potent than the γ subunit is associated to the β3 subunit in the GABAergic complex (α2β3γ2 ≈ α2β1γ2 >> α2β3 ≈ α2β1), and iii) fails to inhibit the chloride current in the absence of gamma subunits. In CHO-UT expressing α2β3γ2 subunits, a 1-sec UII perfusion inhibited the current, and this effect is correlated to the effect of DMCM, a direct allosteric modulator of GABAergic complexes containing a γ subunit. Intracellular calcium mobilization assays on CHO-UT showed that UII provokes an irreversible intracellulaire calcium concentration ([Ca2+]c) increase whereas URP transiently stimulates the [Ca2+]c. UII and URP irreversibly and reversibly inhibits the isoguvacine-evoked current, respectively. We demonstrated that the peptide antagonist [Orn5]-URP is a partial agonist both on the [Ca2+]c and the GABAergic function, and blocks the prolonged effects of UII on each assays. The non-peptidic antagonist palosuran developed by Actelion, fails to modulate the [Ca2+]c, totally abolishes the UII-induced [Ca2+]c increase but mimics the effect of UII on the GABAergic function, i.e. a significant inhibition of the chloride current. The effect of UII, characterized by a fast inhibition (<1s after UII perfusion), followed by a run-down of the Iso-evoked current, is not relayed via G-proteins coupled to UT. However, the long-term UII-induced inhibition partially involves calcium, intracellular kinases/phosphatases and dynamine, a protein known to mediate the GABAA receptor internalization. On CHO-UT transfected with α2β3HAγ2 subunits, we confirmed that UII induces the internalization of the GABAA receptor. We also generated four C-terminal truncated mutants of the UT receptor lacking the 19 (UT370), 38 (UT351), 57 (UT332) and 70 (UT319) amino acids, respectively, and showed that the co-expression of UT370 with the GABAA receptor strongly reduces the fast UII-induced inhibition, and delays the long-term depression of the chloride current. This suggests that the rapid and direct effect of UII involved the distal fragment 370-389 of the UT C-terminus. When the GABAA receptor is coexpressed with UT351, UT332 or UT319, UII totally failed to inhibit the chloride current, indicating that the 351-370 UT sequence plays a major role in the internalization of the GABAA receptor. Taken together, these data demonstrates for the first time the existence of a bidirectional functional interaction between the GABAA receptor and the G protein-coupled receptor for UII, associated with astrocyte plasticity. The UII mechanisms, which do not entirely require classical GPCR-associated signaling pathways, may involve a more “direct” cross-talk between the C-terminal fragment of UT and the γ subunit associated to the GABAA complex. Thus, the extinction of the GABAA receptor expressed at the plasma membrane triggered by the vasoactive peptide UII, would play a major role in astrocyte proliferation following cerebral lesions
Longtemps considérés comme de simples cellules de soutien dans le système nerveux central (SNC), les astrocytes jouent en réalité un rôle clef au sein de l’unité neurovasculaire dans la régulation métabolique, la transmission synaptique et/ou la neurogenèse et la synaptogenèse, via l’expression de nombreux récepteurs/canaux ioniques/transporteurs et la libération de facteurs autocrine et paracrine. A la suite de lésions cérébrales, en particulier après un épisode ischémique, l’astrocytose réactionnelle qui se met alors en place pourrait être contrôlée par des facteurs vasoactifs localement surexprimés. L’urotensine II (UII) et son paralogue l’urotensin II-related peptide (URP) sont deux neuropeptides cycliques considérés comme les facteurs endogènes vasoactifs les plus puissants caractérisés à ce jour. Les travaux réalisés dans notre équipe ont mis en évidence la présence des ARNm codant l’UT et la protéine dans les astrocytes corticaux de Rat en culture, et ont montré que l’UII active les voies Gq-PLC-Ca2+, Gi/o, ou des canaux calciques de type T, et stimule la prolifération astrocytaire. Les différences d’affinité de l’UT pour l’UII et l’URP, et ses différents couplages pourraient s’expliquer par des phénomènes de plasticité dépendants de l’état de prolifération astrocytaire, eux-mêmes sous-tendus par des interactions physiques et/ou fonctionnelles avec d’autres récepteurs. Un exemple de plasticité "récepteur" a été suggéré pour le récepteur GABAA, dont l’expression fonctionnelle à la membrane plasmique est inversement proportionnelle à la capacité de prolifération des astrocytes, après un accident vasculaire cérébral ou dans des tumeurs astrocytaires malignes. Ces données suggèrent donc que le récepteur GABAA est récepteur "répresseur" de prolifération cellulaire. Une étude montrant que l’UII régule la fonction GABAergique dans les neurones d’Aplysie, permettait d’envisager l’existence d’une interaction entre les effets mitogènes de l’UII et répresseur du GABA sur la prolifération astrocytaire en conditions physiopathologiques. Notre projet de recherche a donc consisté i) à montrer que l’UT et le récepteur GABAA sont co-exprimés dans Longtemps considérés comme de simples cellules de soutien dans le système nerveux central (SNC), les astrocytes jouent en réalité un rôle clef au sein de l’unité neurovasculaire dans la régulation métabolique, la transmission synaptique et/ou la neurogenèse et la synaptogenèse, via l’expression de nombreux récepteurs/canaux ioniques/transporteurs et la libération de facteurs autocrine et paracrine. A la suite de lésions cérébrales, en particulier après un épisode ischémique, l’astrocytose réactionnelle qui se met alors en place pourrait être contrôlée par des facteurs vasoactifs localement surexprimés. L’urotensine II (UII) et son paralogue l’urotensin II-related peptide (URP) sont deux neuropeptides cycliques considérés comme les facteurs endogènes vasoactifs les plus puissants caractérisés à ce jour. Les travaux réalisés dans notre équipe ont mis en évidence la présence des ARNm codant l’UT et la protéine dans les astrocytes corticaux de Rat en culture, et ont montré que l’UII active les voies Gq-PLC-Ca2+, Gi/o, ou des canaux calciques de type T, et stimule la prolifération astrocytaire. Les différences d’affinité de l’UT pour l’UII et l’URP, et ses différents couplages pourraient s’expliquer par des phénomènes de plasticité dépendants de l’état de prolifération astrocytaire, eux-mêmes sous-tendus par des interactions physiques et/ou fonctionnelles avec d’autres récepteurs. Un exemple de plasticité "récepteur" a été suggéré pour le récepteur GABAA, dont l’expression fonctionnelle à la membrane plasmique est inversement proportionnelle à la capacité de prolifération des astrocytes, après un accident vasculaire cérébral ou dans des tumeurs astrocytaires malignes. Ces données suggèrent donc que le récepteur GABAA est récepteur "répresseur" de prolifération cellulaire. Une étude montrant que l’UII régule la fonction GABAergique dans les neurones d’Aplysie, permettait d’envisager l’existence d’une interaction entre les effets mitogènes de l’UII et répresseur du GABA sur la prolifération astrocytaire en conditions physiopathologiques. Notre projet de recherche a donc consisté i) à montrer que l’UT et le récepteur GABAA sont co-exprimés dans les astrocytes et à rechercher l’existence d’une interaction fonctionnelle bidirectionnelle entre les deux récepteurs dans ce modèle cellulaire, ii) à caractériser le mécanisme d’action de l’UII sur l’activité GABAergique dans les astrocytes de cervelet en co-culture avec des neurones, et dans une lignée co-exprimant l’UT et les sous-unités du récepteur GABAA humain, et iii) à identifier les séquences d’interaction permettant le rapprochement de l’UT au récepteur GABAA, et sa régulation fonctionnelle. Sur des astrocytes corticaux de Rat en culture, nous avons montré pour la première fois que l’UII entraîne une augmentation concentration-dépendante de la production d’AMPc. Cet effet est totalement bloqué par le SQ22536, un inhibiteur d’adénylyl cyclase, alors qu’il est exacerbé en présence d’un inhibiteur de PKA, le H89, suggérant l’existence d’un rétrocontrôle négatif du système adénylyl cyclase/AMPc/PKA sur la fonction de l’UT. De plus, l’UII stimule de façon concentration-dépendante le métabolisme des polyphosphoinositides (PIPs), un effet qui est fortement inhibé en présence de H89. L’ensemble de ces données suggère donc que l’UII entraîne la production d’AMPc et l’activation d’une PKA, qui pourrait catalyser le changement de couplage de l’UT des protéines Gs aux protéines Gi d’une part, et Gq d’autre part. Enfin, nous avons démontré que l’activation du récepteur GABAA inhibe les effets de l’UII sur le métabolisme des PIPs ainsi que sur la production d’AMPc, révélant l’existence d’une régulation négative de la fonction urotensinergique par le récepteur GABAA dans les astrocytes. Des expériences de double marquage réalisées sur des tranches de cervelet de Rat révèlent que l’UT et les sous-unités γ1 et γ2 du récepteur GABAA sont principalement coexprimés au sein de fibres astrocytaires dans la couche moléculaire ainsi que dans les cellules de Purkinje. Sur des co-cultures astrocytes/neurones de cervelet, l’UT et les sous-unités γ1 et γ2 sont majoritairement exprimés dans les astrocytes. Dans ce modèle de co-culture, nous avons montré que l’UII inhibe la dépolarisation membranaire et atténue de manière concentration-dépendante l’amplitude du courant chlore évoqué par l’agoniste du récepteur GABAA, l’isoguvacine. Sur les lignées CHO exprimant stablement l’UT humain (CHO-UT) et transitoirement transfectées par différentes combinaisons en ADNc codant différentes sous-unités du récepteur GABAA humain, l’UII i) inhibe significativement l’amplitude du courant Cl- dès la concentration de 10-13 M (β3γ2 ≈ α2β3γ2 ≈ α2β1γ2 > α2β3γ1 > α2β1γ1), ii) est d’autant plus puissant que la sous-unité γ est associée à la sous-unité β3 du complexe GABAergique (α2β3γ2 ≈ α2β1γ2 >> α2β3 ≈ α2β1), et iii) devient inactif lorsque les sous-unités γ ne sont pas associées au récepteur GABAA. Sur les cellules CHO-UT exprimant le complexe α2β3γ2, l’UII, perfusée pendant seulement 1 s, est déjà capable d’entraîner une diminution du courant, un effet qui est corrélé aux effets du DMCM, un modulateur allostérique direct de la fonction des complexes GABAergiques composés des sous-unités γ. A l’aide d’un système d’imagerie dynamique, nous montrons que l’UII entraîne une augmentation irréversible de la concentration cytosolique de calcium ([Ca2+]c) alors l’URP stimule transitoirement la [Ca2+]c dans les CHO-UT. De même, l’UII et l’URP inhibent irréversiblement et réversiblement le courant chlore évoqué par l’isoguvacine, respectivement. Nous montrons, que l’antagoniste peptidique [Orn5]-URP, se comporte comme un agoniste partiel de l’UT sur la [Ca2+]c et sur la fonction GABAergique, capable de bloquer les effets prolongés de l’UII sur ces deux effecteurs. De plus, le palosuran, un antagoniste non-peptidique développé par Actélion, ne présente pas d’activité propre, abolie totalement l’effet de l’UII sur la [Ca2+]c mais en revanche, inhibe significativement la fonction GABAergique, mimant ainsi les effets de l’UII. L’effet de l’UII, caractérisé par une inhibition rapide (<1 s après l’application d’UII), suivie d’une diminution progressive de l’amplitude du courant au cours du temps, n’est pas relayé par les protéines G associées à l’UT. En revanche, l’inhibition observée à long-terme est partiellement dépendante du calcium, des kinases/phosphatases intracellulaires, et met en jeu la dynamine, une protéine classiquement impliquée dans le processus d’internalisation du récepteur GABAA. Nous confirmons en effet que sur des CHO exprimant l’UT et les sous-unités α2β3HAγ2, l'UII provoque l’internalisation du récepteur GABAA. A l’aide de 4 mutants de l’UT délétés dans la partie C-terminale de 19 (UT370), 38 (UT351), 57 (UT332) et 70 (UT319) acides aminés, respectivement, nous montrons que lorsque le récepteur GABAA est coexprimé avec le mutant tronqué UT370, l’effet rapide de l’UII est fortement réduit et l’inhibition à long terme du courant chlore est retardée, suggérant que le fragment distal 370-389 relaye l’effet rapide et direct de l’UII. Lorsque le récepteur GABAA est co-exprimé avec les mutants UT351, UT332 ou UT319, l’UII est sans effet sur la régulation du courant GABAA, indiquant que la séquence comprise entre les acides aminés 351 et 370 joue un rôle majeur dans le processus d’internalisation du récepteur GABAA. L’ensemble de ces données démontre pour la première fois l’existence d’une interaction fonctionnelle bidirectionnelle entre le récepteur GABAA et le récepteur couplé aux protéines G de l’UII, associée particulièrement à la plasticité astrocytaire. L’activation de l’UT inhibe rapidement la fonction GABAergique, conduisant à l’extinction progressive du récepteur GABAA à la membrane plasmique via son internalisation. Les effets de l’UII, partiellement indépendants des voies de signalisation classiquement associées aux RCPG, suggèrent l’existence d’un couplage "direct" entre le fragment C-terminal de l’UT et la sous-unité γ associée au complexe récepteur GABAA. De fait, la perte du rôle répresseur du récepteur GABAA engendrée par le peptide vasoactif UII pourrait jouer un rôle majeur dans la prolifération astrocytaire au cours de lésions cérébrales.
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Thomas Lefebvre. Mise en évidence d’une interaction fonctionnelle entre le récepteur GABAA et le récepteur du peptide vasoactif urotensine II : implication potentielle dans la fonction astrocytaire.. Sciences du Vivant [q-bio]. Université de Rouen, 2010. Français. ⟨NNT : ⟩. ⟨tel-02351434⟩
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