Modification d’une phase stationnaire de carbone graphitique poreux (PGC) pour l’analyse robuste à haut débit de marqueurs épigénétiques chez l’Homme par HPLC-MS/MS
Résumé
Le développement des cancers et leurs progressions est intimement lié aux altérations épigénétiques. La méthylation de la cytidine est l’une de ces modifications, très souvent étudiée dans la littérature [1]. Cependant les données sur l’hydroxyméthylation de ce nucléoside sont plus rares alors qu’il a également été associé à la survenue de cancers [2]. Deux approches de l’étude des altérations épigénétiques est possible : (i) la méthylation de loci spécifiques la plus couramment étudiée reflète des modifications dans l’expression de certains gènes ou (ii) l’analyse des modifications épigénétiques sur l’ensemble du génome, reflétant des perturbations entrainant des modifications épigénétiques détectables sur l’ensemble de l’ADN (y compris les régions non codantes).
Notre objectif était d’analyser la méthylation et l’hydroxyméthylation globales de l’ADN extrait de neutrophiles issus de sang humain par LC-MS/MS. Diverses méthodes sont utilisées dans la littérature pour analyser la méthylation de l’ADN, telle que l’utilisation de kits ELISA ou la PCR [3]. Cependant, la spécificité de la LC-MS/MS est supérieure à celle des autres techniques [4]. De plus, il s’agit d’une méthode plus robuste, automatisable, et donc plus adaptée à l’analyse de grandes séries d’échantillons. Il n’existe cependant à ce jour pas de méthode publiée et validée permettant l’analyse de la 5-hydroxymethylcytidine par LC-MS/MS. L’objectif de cette étude a donc été la mise au point d’une méthode d’analyse robuste permettant la séparation et la détection de ces deux marqueurs épigénétiques par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse. La 5-hydroxymethylcytidine étant un composé très polaire et soluble uniquement dans l’eau, les colonnes C18 ne permettent pas sa rétention et le mode HILIC pose des problèmes de solubilité. L’ADN analysé est préparé par une étape automatisée d’hydrolyse enzymatique avant son injection. Il est indispensable d’avoir un facteur de rétention suffisant pour les deux composés afin d’éviter la suppression ionique due au pic de matrice. Une colonne de type carbone graphite poreux doit permettre la rétention de composés polaires dans un échantillons aqueux [5]. Les pics obtenus avec une colonne Hypercarb (150*3 mm, 5μm, Thermo Scientific, Waltham, Etats-Unis) sont cependant déformés et la rétention est trop élevée pour permettre une analyse rapide. Des modificateurs de phases sont généralement utilisés pour améliorer la qualité de séparation et perturber les interactions non souhaitées [6]. La triéthylamine et l’acide trichloracétique sont classiquement utilisés dans ce genre de cas de figure. Ces composés sont cependant non compatibles avec un couplage à la spectrométrie de masse car ils inhibent le signal. Suite aux modifications de la phase stationnaire, la colonne est donc rincée avant son installation sur le système de spectrométrie de masse. L’adsorption des modificateurs est ainsi maintenue dans la colonne sans perturber le signal en spectrométrie de masse.
La colonne finalement obtenue a été utilisée pour l’analyse de 550 échantillons issus d’une cohorte française d’affiliés à la mutuelle agricole (MSA). Les analyses se sont étalées sur deux semaines et la colonne a été reconditionnée une fois durant cette période. Un contrôle a été injecté tous les 8 échantillons, en alternant concentration basse, moyenne et haute afin de vérifier la justesse des résultats. De plus, un étalon interne marqué au 13C pour la 5-méthylcytidine et au 2H pour la 5 hydroxyméthylcytidine a été utilisé pour chaque composé. Les échantillons sont analysés par plaques de 96 puits. Au cours d’une série de 96 échantillons le coefficient de variation du temps de rétention est de 0,63% pour la 5-méthylcytidine (inférieur à 5 secondes entre les temps de rétention maximum et minimum) et de 0,70% pour la 5-hydroxyméthylcytidine (inférieur à 8 secondes de différence entre les temps de rétention maximum et minimum). Le coefficient de variation pour la concentration obtenue dans le contrôle le plus bas est inférieur à 5%. L’analyse des résultats a permis de suivre les variations de ces marqueurs épigénétiques dans la population étudiée. La méthylation, l’hydroxymethylation ainsi que le rapport de leurs concentrations ont été suivis et leurs variations ont pu être associées à diverses habitudes de vie des participants.
[1] Skvortsova, K., Stirzaker, C., Taberlay, P., Essays Biochem. 2019, 63, 797–811.
[2] Pfeifer, G. P., Kadam, S., Jin, S.-G., Epigenetics Chromatin 2013, 6, 10.
[3] Khodadadi, E., Fahmideh, L., Khodadadi, E., Dao, S., Yousefi, M., Taghizadeh, S., Asgharzadeh, M.,
Yousefi, B., Kafil, H. S., BioMed Research International 2021, 2021, 1–9.
[4] Pinho, A. R., Fortuna, A., Falcão, A., Santos, A. C., Seiça, R., Estevens, C., Veiga, F., Ribeiro, A. J.,
Comparison of ELISA and HPLC-MS methods for the determination of exenatide in biological and
biotechnology-based formulation matrices. Journal of Pharmaceutical Analysis 2019, 9, 143–155.
[5] Gautam, N., Alamoudi, J. A., Kumar, S., Alnouti, Y., J. Pharm. Biomed. Anal. 2020, 178, 112902.
[6] Skvortsova, K., Stirzaker, C., Taberlay, P., Essays in Biochemistry 2019, 63, 797–811.
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