RNA˸DNA hybrids biology in the processing of dysfunctional replication forks by homologous recombination
Métabolisme des hybrides ARN˸ADN et sauvetage des fourches de réplication par la recombinaison homologue
Résumé
Maintaining genome stability is essential to ensure the high-fidelity transmission of genetic information. Genome instability results in increased mutation rate and chromosomal aberrations, followed by their missegregation during mitosis. Such abnormalities, in turn, may lead to many human disorders and are a well-recognized hallmark of most cancer cells. A major cause of instability is the alteration of DNA replication dynamics, also known as replicative stress. Indeed, the fulfillment of DNA replication is constantly threatened by replication fork barriers leading to the slowdown or the arrest of replication forks. One of the major structures likely to impair fork progression are R-loops, co-transcriptionally forming RNA:DNA hybrids. Interestingly, aside the arguments considering R-loops as threats for genome integrity, they are involved in regulating gene expression. Also, RNA:DNA hybrids form at DNA double-strand break sites, where they modulate positively, as negatively, the repair machineries. Their controlled degradation is a necessary step for homologous recombination-mediated repair. My thesis project aimed to decipher whether RNA:DNA hybrids associated with replication stress could be formed as a consequence of the recombination-dependent replication restart process of arrested forks. To do so, I exploited a site-specific replication fork barrier (RTS1-RFB) developed by the team in fission yeast. Well-controlled and conditional RFB had been integrated into the S. pombe genome to induce at a site-specific locus, a single dysfunctional replication fork, independently of transcription activity. I identified a novel RNA:DNA hybrid-related mechanism to overcome the NHEJ factor Ku-mediated barrier to nascent strand degradation. RNAse H activities promote nascent strand degradation and replication restart with a prevailing role of RNAse H2’s ability to process RNA:DNA hybrids to engage physiological and pathological fork-resection. RNase H2 acts in a parallel pathway to MRN-Ctp1 to sustain cell resistance to replication stress, in a Ku-dependent manner. Mechanistically, RNAse H2 allows bypassing the Ku-mediated barrier to initiate the short-range resection by processing RNA primer of Okazaki Fragments. Finally, I found that replication stress favors Ku binding to RNA:DNA hybrids, indicating a novel function for Okazaki fragments in controlling Ku-mediated barrier to safeguard fork integrity. These results shed lights on how RNase H2 acts at arrested forks while implementing new aspects of the relationship between post-replicative forming RNA:DNA hybrid structures and the replication stress response. RNase H2 dysfunctions are associated with more than 50% of the Aicardi-Goutières syndrome cases. The molecular causes of this inflammatory syndrome are steal poorly understood, and this work could contribute to better characterized the molecular mechanisms involved in the pathology.
Des défauts de réplication de l’ADN, autrement connus sous le terme de stress réplicatif, sont une source d’instabilité génétique qui peuvent conduire à l’entrée en mitose de cellules ayant un génome partiellement répliqué. Le stress réplicatif a été associé chez l’homme à de nombreuses pathologies comme les cancers ou des syndromes neurologiques et inflammatoires. L’altération de la progression des fourches de réplication est une des causes principales du stress réplicatif. C’est entre autres la formation de R-loops, des hybrides ARN:ADN formés de manière co-transcriptionnelle, qui compromet le maintien de la stabilité du génome notamment via l’augmentation des risques de collision entre les machineries de réplication et transcription. Bien qu’étant des éléments régulateurs de l’expression génique, les R-loops peuvent être génotoxiques si leur formation n’est pas contrôlée. Récemment, il a été proposé que des hybrides ARN:ADN se forment lors de la réparation des cassures d’ADN double-brin. Ils seraient des intermédiaires du processus de réparation, jouant des rôles positifs comme négatifs, sur les machineries de réparation. La dégradation contrôlée des hybrides ARN:ADN est une étape nécessaire pour achever la réparation des cassures d’ADN double-brin par la recombinaison homologue. Mon projet de thèse vise à déterminer si les hybrides ARN:ADN associés au stress réplicatif seraient formés en conséquence du processus de redémarrage des fourches de réplication bloquées par la recombinaison homologue. J’ai exploité un système de blocage de fourche conditionnel, le système RTS1, permettant de bloquer une fourche de réplication donnée à un locus défini, indépendamment de la transcription. J’ai étudié les conséquences de la stabilisation des hybrides ARN:ADN sur l’intégrité et le devenir de cette fourche bloquée. J’ai pu identifier que la dégradation d’hybrides ARN:ADN permet d’initier la résection des brins naissants, étape contrôlée par la présence du facteur de NHEJ Ku. L’activité des enzymes RNase H promeut la résection et le redémarrage des fourches bloquées, et c’est notamment RNase H2 qui a un rôle clé pour initier la dégradation, physiologique comme pathologique, des brins naissants. RNase H2 agit dans une voie parallèle à celle de MRN-Ctp1, dépendamment de la présence de Ku. Plus précisément, RNase H2 permet, en éliminant l’amorce ARN du dernier fragment d’Okazaki, de contrecarrer le rôle protecteur de Ku contre la résection des fourches bloquées. Enfin, j’ai observé que l’induction d’un stress de réplication favorise la fixation de Ku sur des hybrides ARN:ADN. Ces observations mettent en avant une nouvelle fonction pour les fragments d’Okazaki dans le contrôle de l’intégrité des fourches bloquées. Ces travaux contribuent à mieux définir le rôle de RNase H2 aux fourches bloquées, et mettent en lumière le rôle d’hybrides ARN:ADN formés de manière post-réplicative dans la mise en place de la réponse cellulaire au stress réplicatif. Des mutations de RNase H2 sont associées à plus de 50% des cas du syndrome d’Aircardi-Goutières, un syndrome inflammatoire dont les tenants moléculaires sont encore mal compris. Les résultats présentés dans ce manuscrit pourraient aider à clarifier les mécanismes moléculaires impliqués dans cette pathologie.
Origine : Version validée par le jury (STAR)